Книга по генетике

Страница: 6/52

поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сег-

менты ДНК также могут быть клонированы с использованием ме-

тода скользящего зондирования.

Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно

отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых

других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;

Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,

1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три

группы. В первой группе исследуют структурные особенности

генных последовательностей. Вторая группа критериев основана

на поиске функциональных участков генов. В третьем случае

анализируют характер нуклеотидных последовательностей тести-

руемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков ге-

нов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым

скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диаг-

ностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping),

промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей,

а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в

них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов

может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных

фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклео-

тидной последовательности и сопоставлением её с присутствую-

щими в базах данных идентифицированными генами других видов

живых существ.

Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов,

представленные в геноме уникальными последовательностями,

достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует

высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми

генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан,

так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последова-

тельностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную

гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов жи-

вотных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,

птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последова-

тельности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в

инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркиру-

ющих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно ге-

нов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют на-

личие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).

Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть

осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей

нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клони-

рованные ДНК из этого интервала могут быть сразу использова-

ны для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).

Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК

гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в

тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой

целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум

критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих

тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библио-

теки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным

первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из

пораженных органов и тканей. При обнаружении последователь-

ностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою

очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления

всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К

сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридиза-

ция может не дать положительных результатов.

Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным крите-

риям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК,

являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность

выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализован-

ного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные

доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК

специфическому гену. Такие доказательства могут быть получе-

ны, например, при определении нуклеотидной последователь-

ности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последова-

тельностью кодируемого этим геном белка. Веским доказа-

тельством в пользу правильности проведенной идентификации

гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в

изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих

соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,

при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клони-

руемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная

мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, реша-

ющим аргументом правильности идентификации нужного гена яв-

ляется успешно осуществленная с его помощью генокоррекция

первичного биохимического дефекта, выполненная на соот-

ветствующих культурах мутантных клеток, или получение стой-

кого терапевтического эффекта у трансгенных животных - био-

логических моделей данного наследственного заболевания.

Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с ге-

номными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта

оценка имеет важное значение для реконструирования полнораз-

мерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию

гена, так как позволяет определить его границы в геномной

ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и ре-

гуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последова-

тельность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать амино-

кислотную последовательность соответствующего белка и таким

образом определить первичное биохимическое звено в патогене-

зе соответствующего наследственного заболевания.

Описанный способ изучения молекулярных и биохимических

основ наследственных заболеваний получил название обратной

генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от

белка к гену, так называемого функционального клонирования,

был назван позиционным клонированием, тем более, что термин

обратной генетики уже использовался ранее для обозначения

метода анализа функции гена путем направленного введения в

него мутаций (Collins, 1992).

Возможность использования функционального клонирования

зависит от доступности информации о белковом продукте и/или

о функции соответствующего гена. Для подавляющего боль-

шинства моногенных болезней определение первичного биохими-

ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу

из-за недостаточного понимания функционирования огромного

числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,

низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделе-

ния и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о

клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохи-

мический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных

о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности

генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их

сегментов, реальные соотошения функционального и позиционно-

го клонирования в идентификации генов, ответственных за

наследственные заболевания, быстро меняются в сторону бе-

зусловного доминирования последнего.

Успех позиционного клонирования определяется возмож-

ностями картирования гена, при этом функция гена исследуется

уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8

представлена общая схема позиционного клонирования, за-

имствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для

нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления

используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения

хромосомной принадлежности картируемого гена более

точная локализациия может быть установлена с помощью при-

цельного отбора дополнительных индексных маркеров из опреде-

ленного цитогенетического сегмента. Картирование гена, оп-

ределяющего наследственное заболевание, может быть значитель-

но ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически

видимой структурной перестройки в области локализации этого

гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие паци-

енты, как правило, встречаются редко, но описание даже одно-

го такого случая может исключить необходимость картирования

гена путем последовательного анализа его сцепления с генети-

ческими маркерами целого генома и позволит перейти не-

посредственно к молекулярному клонированию. Именно таким об-

разом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,

миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-

рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных

болезней.

С другой стороны, в ряде случаев удается исключить дли-

тельный процесс молекулярного клонирования, используя метод

"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахож-

дение транскрибируемых областей генома, улавливание экзонов

и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование

методами гибридизации in situ большого количества анонимных

кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифи-

ческих библиотек, все это в комплексе приводит к значитель-

ному увеличению степени насыщенности различных сегментов

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125169 прочтено)