Книга по генетике

Страница: 4/52

ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов

обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко-

вых систем, контролируемых разными генами, локализованными

во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были

найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти-

фицированы соответствующие группы сцепления.

Совершенствование молекулярных методов анализа специфи-

ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо-

го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай-

тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных

последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы-

ла использована для маркировки участков хромосом с целью

установления более точного взаиморасположения локусов. Вско-

ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были

опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10

до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро-

мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно

для определения хромосомной принадлежности генов, от-

ветственных за любой тип наследственной изменчивости

(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин-

дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех

известных генов на основании анализа сегрегации соответству-

ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре-

деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки

генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-

номерно распределенных полиморфных маркеров.

Идентификация в геноме человека большого числа поли-

морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана-

лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно

повысили возможности локализации неизвестных признаков на

геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000

клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли-

морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-

ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи-

ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени

это анонимные последовательности, связь которых со специфи-

ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего

соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло-

на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая

номенклатура для обозначения используемых в качестве марке-

ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,

что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-

ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-

мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.

Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-

нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-

кая информативность (частота гетерозигот не может превышает

50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение

ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-

шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-

тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК

последовательностей в качестве индексных генетических марке-

ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-

ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-

лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно

распределенных по хромосомам практически завершенаа

(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система

построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.

(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс

простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-

чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-

мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных

на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются

после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более

90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-

ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В

1992г. группе французских ученых под руководством Жана

Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-

мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации

(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из

814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-

нием между ними около 5 сМ, получившую название

Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et

al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000

фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем

ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры

для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-

жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.

Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000

(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих

участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-

дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-

лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-

тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-

держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта

сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-

нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.

Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а

суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%

всего генома человека.

К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до

2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен

до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти-

вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста-

ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру-

ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического

скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих

весь геном человека со средним расстоянием между соседними

маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из

Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни-

ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по-

лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),

причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены

четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково-

го молекулярного веса можно было различить на электрофорег-

рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9

STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо-

ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.

Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим

сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.

Только с помощью одного автоматического сканнера удается

проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в

день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва-

ет самые широкие возможности не только для генетического

картирования и создания подробных карт сцепления практически

любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,

она делает реальной разработку стратегии картирования генов,

мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-

леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,

психозы и многое другое.

Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,

пульсирующий гель-электрофорез.

Используя столь обширную систему молекулярных маркеров

и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур

или на материале информативных родословных можно довольно

быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не

только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-

ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-

посредственно к позиционному клонированию с целью выделения

и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в

картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим

подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-

ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-

мосом и их фрагментов.

Точность цитогенетического картирования определяется

степенью спирализации хромосом, характером использованной

метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-

вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах

и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-

рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-

том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При

использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах

точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1

миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и

растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50

тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,

даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар-

тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-

чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.

Значительно более точные результаты достигаются на 2-м

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125464 прочтено)