Книга по генетике

Страница: 29/52

уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и

их используют, обычно, для производства большого количества

чистого белка, необходимого для получения антител или для

фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе-

ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем

сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь-

ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му-

тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи-

мости различных участков белка.

Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет-

ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем

в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют

ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти-

ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее

использовать для изучения посттрансляционных модификаций

белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп-

тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо-

ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения

дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую-

щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может

быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить

его в кристаллической форме и исследовать пространственную

структуру и функциональное назначение отдельных доменов

(Хэймс, Хиггинс, 1987).

Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко-

дирующих последовательностей гена рассматривалось ранее (см.

Глава II). После секвенирования кДНК можно, исходя из гене-

тического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и

произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных

последовательностей в составе белков с уже известной струк-

турой и функциями. Выявление родственных белков, близких по

своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег

чает дальнейший молекулярный анализ функционирования иссле-

дуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность

белка позволяет прогнозировать его третичную структуру,

идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость

целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным

практическим следствием этих данных является также возмож-

ность получения антител к строго специфичным участкам бел-

ка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохими-

ческий и молекулярно-генетический. В первом случае для имму-

низации используют искусственно синтезированные полипептиды,

которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену).

Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 амино-

кислот - они не могут быть очень большими из-за высокой сто-

имости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором

подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный

вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В резуль-

тате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в

котором наряду с аминокислотной последовательностью селекти-

руемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемо-

го белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации

животных и получения моновалентных или моноклональных анти-

тел. При наличии антител могут быть применены различные им-

мунологические подхооды для анализа тканеспецифического и

внутриклеточного распределения белка, исследования его моди-

фикаций, а также для получения нативного белка в препаратив-

ных количествах.

Cледующим шагом на пути анализа молекулярных механизмов

регуляции экспрессии гена является идентификация тех наруше-

ний в структуре, локализации и активности молекул мРНК и

белка, которые возникают вследствие генетических мутаций. Мы

уже упоминали об огромном значении культур мутантных клеток

для подобных исследований. Однако, многие патологические

процессы, протекающие в организме больного, не могут быть

исследованы in vitro. С другой стороны, возможности получе-

ния необходимого количества клеток и тканей пациента и испы-

тания in vivo различных схем лечения значительно ограничены.

Поэтому для многих наследственных болезней эффективность

изучения основ патогенеза существенным образом зависит от

наличия адекватных биологических моделей. Способы конструи-

рования таких моделей подробно изложены в Главе YIII.

ГЛАВА II.

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.

Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-

тов.

Термин геном используется для обозначения полной гене-

тической системы клетки, определяющей характер онтогенети-

ческого развития организма и наследственную передачу в ряду

поколений всех его структурных и функциональных признаков.

Понятие генома может быть применено к таксономической груп-

пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви-

русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про-

кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности

строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из-

менениями, происходящими в геноме специфических клеток в

процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном

определяется как генетическая информация, заключенная в мо-

лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как

отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид-

ный геном и таксономическим статусом видов, а также много-

численные примеры существования огромных различий в содержа-

нии ДНК между близкородственными видами (так называемый

"С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все

участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия ге-

нома и ДНК в значительной степени тождественны, так как

основные принципы организации и функционирования генома це-

ликом определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам

потенциальные возможности практически неограниченного струк-

турного разнообразия определяют все многообразие мира живых

существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных раз-

личий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985).

Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как

правило, сопровождался накоплением изменений в структуре ге-

нома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как ло-

кализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК,

приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функ-

ции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь-

ностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариа-

бильность и филогенетический консерватизм первичной структу-

ры генома. В пределах одного вида основные параметры генома

достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечи-

вается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения,

вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших

участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются не-

экспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов,

межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.).

Геномы эукариот, по-существу, можно рассматривать как

мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из обли-

гатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу

облигатных элементов составляют структурные локусы, коли-

чество и расположение которых в геноме достаточно постоянно.

Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК,

амплифицированных участков, ретровирусных последователь-

ностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, рет-

ротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и раз-

личных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) явля-

ется не строго обязательным, их количество и положение может

значительно варьировать, то есть эти элементы являются фа-

культативными. В то же время участие факультативных элемен-

тов в наследственной передаче признаков, в формировании му-

тационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях ви-

дов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный

переход от одних состояний к другим за счет инсерции

экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозо-

ноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно,

несмотря на значительные отличия факультативных последова-

тельностей от облигатных по характеру основных информацион-

ных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегре-

гации), они также должны рассматриваться, как важнейшие эле-

менты генома.

Остановимся теперь более детально на основных принципах

организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46

хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина

гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар

нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для

кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим

независимым оценкам истиное число структурных генов нахо-

дится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложе-

ны современные подходы, используемые для подсчета общего ко-

личества генов, из которых следует, что наиболее вероятная

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125470 прочтено)