Книга по генетике

Страница: 25/52

тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-

тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на

рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-

зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК

последовательности, комплементарные зонду, или специфические

антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных

культурах производят именно в тех местах, где произошло по-

темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,

отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-

нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и

субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать

большие количества этой ДНК.

1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.

Следующими этапами анализа отобранного и клонированного

ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-

ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-

ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-

ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул

ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,

однако, определение нуклеотидной последовательности протя-

женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-

дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-

ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -

метод Сэнджера. В первом случае используют химическое

расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют

нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез

на заданном основании.

Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так

как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-

го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-

руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют

секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-

нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-

ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-

ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного

участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную

смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,

один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-

рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют

один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов

- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на

место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.

Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-

щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и

тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-

ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-

ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-

рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов

может быть определен, а значит и определена локализация ди-

дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов

в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем

геле может быть определена первичная последовательность все-

го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте

этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.

Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК

в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет

назад оценивалась в 1$.

В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-

варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных

на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых

участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-

ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-

залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс

одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-

шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология

автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным

для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-

лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-

нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-

ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается

автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение

в реализации программы Геном человека. По последним данным,

разработка автоматических секвенаторов позволила снизить

стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-

ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах

фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-

но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.

В последние годы активно разрабатываются принципиально

новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-

ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой

последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-

ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский

и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для

этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых

пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-

да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-

рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-

деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество

возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-

емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют

с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется

только с теми октануклеотидами, последовательности которых

комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-

бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-

дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной

компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-

тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод

позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет

автоматизации процесса.

1.7 Полимеразная цепная реакция.

До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони-

рование являлись единственными способами поиска и выделения

специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей

ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о

большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи-

альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые

фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш-

ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих

последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так

как определяются наличием соответствующих рестрикционных

сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе-

ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое

количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК

(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК

обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока-

зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях

и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед-

ленного использования собранной крови для выделения ДНК или

хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова-

ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи-

вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент-

ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не-

обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив-

ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны

быть использованы в течение очень короткого периода после их

приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом

требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали-

чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно

лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не-

обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд-

линяет время получения результатов, что также ограничивает

использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди-

агностики плода, специфика которой во многом определяется

сроком беременности.

Предложенный в 1983г. американским исследователем

Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской

премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -

метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным

открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или

специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте-

зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной

от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,

реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые

образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.

Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук-

леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,

так как специфический выбор этого участка осуществляют путем

гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-

ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125149 прочтено)