Страница: 45/52
нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В ре-
зультате образуется животное - химера, состоящее из клеточ-
ных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского
генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по
генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь попереч-
ную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, неза-
висимым образом полученные в результате введения в одинако-
вые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут
отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как
все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся
и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные
животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки
и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво пе-
редавать своим потомкам генетическую информацию, содержащую-
ся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми транс-
миттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть по-
томков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то
есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом ти-
пе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, ис-
кусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких
гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по задан-
ной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том
случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном
состоянии у животных этого вида.
Возможность вести селекцию нужных мутантных или
трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в ка-
честве клеточных векторов нашло широкое применение в генети-
ческом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обра-
батывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отби-
рали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем
использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.
Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Ни-
хана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы
(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной
доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генети-
ческого моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ-
фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомоло-
гичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При
трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомби-
нантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде
кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит ин-
теграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина
путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты
хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов
устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК мо-
жет быть повышена при использовании линейных плазмид и спе-
циальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной
ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной
ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды
или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего
в качестве маркера используют прокариотический ген neo, со-
общающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых
произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут
образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418,
содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток
будут в этих условиях деградировать.
Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.
Наиболее важным шагом на пути искусственного получения
мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с
сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако,
случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их
общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются
попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в
них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы не-
которые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у чело-
века. Однако, в любом случае схемы направленной модификации
генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые
направленная сайт-специфическая модификация была выполнена
также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (см.выше)
и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделиру-
ющая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у че-
ловека (Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в
первую очередь, обусловлен существованием простых схем отбо-
ра клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном
на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован
в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.
При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсер-
цией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифи-
цируются - Рис.8.1 (см. Главу X).
В настоящее время предложено несколько вариантов для
направленного переноса неселектируемых генов за счет допол-
нительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого
маркерного гена в таком положении, при котором его экспрес-
сия происходит преимущественно при правильном встраивании
векторной последовательности в ген-мишень (рис.8.2). Так,
маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК
плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться
только находясь под контролем какого-либо другого промотора
хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна
произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.
При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет
Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к
резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомо-
логичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На
этом же принципе основано использование генетических конс-
трукций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности
в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов
среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридиза-
ции, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной пос-
ледовательности, расположенный вне направленно переносимого
участка экзогенной ДНК.
Особенно перспективным на сегоднешний день представля-
ется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Ме-
тод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция
экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где
встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.
Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными
последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК
плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный
вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции
такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбина-
ции HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при
негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в
неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противо-
герписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться ги-
белью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу
(Рис.8.3).
Отбор клеток с модифицированным геном также может про-
изводиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо
маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для
амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло-
гичен соседней с сайтом интеграции последовательности моди-
фицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируе-
мой экзогенной ДНК (Рис.8.4). Метод позволяет обнаруживать
присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди
50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в
каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При
положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и
процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать
нужные клоны.
Направленное выключение генов-мишеней может быть достиг-
нуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации
могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей,
наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена
и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и
трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет
инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего
образуется укороченный белок, незащищенный от действия кле-
точных протеаз.
Более совершенной является разработанная недавно техни-
ка двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные
по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе
ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и
прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в
нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последо-
вательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мише-
ни. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы
(Рис.8.5). После трансфекции отбираются клетки позитивные по
HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких
клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологич-
Реферат опубликован: 26/04/2005 (125171 прочтено)