Страница: 33/52
белка или к потере его функции, что, как правило, драмати-
ческим образом сказывается на жизнеспособности особей, несу-
щих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека
состоит из некодирующих последовательностей, подобных сател-
литным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным проме-
жуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы
и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или
полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не
оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репро-
дуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных
прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы
являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа
родословных можно проследить их наследование в ряду поколе-
ний, проанализировать сцепление друг с другом, с известными
генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть
использовать в качестве обычных менделевских признаков в
классическом генетическом анализе. Информативность полиморф-
ных локусов определяется уровнем их генетической изменчи-
вости в различных популяциях.
Экспериментально легко выявляются два варианта геномно-
го полиморфизма. Количественые изменения в области локализа-
ции мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и ка-
чественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появ-
лению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае измен-
чивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию
аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого
вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан
с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых,
как правило, в уникальных последовательностях некодирующих
участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генети-
ческого кода (см.Глава 1) могут возникать и в кодирующих
последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в
сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре-
зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом,
при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.
Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хро-
мосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на
300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и исполь-
зован для молекулярной маркировки специфических участков ге-
нома исторически раньше по сравнению с вариабильными сател-
литными повторами (Botstein et al.,1980).
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть
легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагмен-
тов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Ана-
лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы-
ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном-
ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро-
форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден-
тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест-
рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).
При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо-
реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения
ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот-
ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя
соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо-
нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на
электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам
фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест-
рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С
каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному
локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа-
ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае
возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест-
рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-
тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест-
рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак-
тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в
десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда-
ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по-
лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты
изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию
и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте
ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-
личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли-
ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо-
мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об-
ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в
нижней области геля, соответствующий более короткому фраг-
менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по-
лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в
верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,
тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,
если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер-
жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния
этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп-
лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в
исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента
не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа-
зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области
сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины
(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,
один из которых по длине будет соответствовать размеру амп-
лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же
суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова-
ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож-
ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных
варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по-
лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге-
нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон-
дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной
нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют
широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде-
ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих
собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят
ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име-
ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из
популяций аналогичные исследования проводят в других популя-
циях.
Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции
всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да-
же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге-
терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет
превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного
сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный
аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную
маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по-
лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо
более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными
сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель-
ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -
90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых
микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове-
ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они
достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро-
мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто-
ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро-
вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach
et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных
последовательностей различают варьирующие по числу тандемные
повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а
также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко-
полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме
превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,
1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по
числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -
ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с
контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et
al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно-
ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,
можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных
или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно-
типную коровую последовательность. Примером может служить
VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122262 прочтено)