Страница: 28/52
налов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов
(трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого орга-
низма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных
манипуляций трансгенные животные могут быть также использо-
ваны в качестве модельной системы для анализа механизмов
тканеспецифической активации генов in vivo.
Матричная РНК является наиболее удобным обьектом для
изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных
модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК сотоит на 90 - 95%
из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля трансли-
руемых или poly(A)+ РНК не превышает 5% (Льюин, 1987). При
этом, концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов
среди всех молекул мРНК, в среднем, колеблется в пределах от
0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Поэтому для обнаружения
индивидуальных типов мРНК должны использоваться высоко-
чувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на
тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ
РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических
срезах (Хаффнер, Уиллисон,1990). В качестве ДНК-зондов
используют клонированные последовательности кДНК и синтети-
ческие олигонуклеотиды. После инкубации меченых зондов на
цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой
несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последо-
вательностей в клетках определяют радиоавтографическими, ли-
бо в случае биотинового мечения - иммуногистохимическими ме-
тодами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не
только выявлять присутствие специфических мРНК, но и опреде-
лить их внутриклеточную локализацию (Манк, 1990; Хаффнер,
Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).
Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей
пула неповрежденных биологически активных мРНК и идентифика-
цию среди них специфических молекул путем использования раз-
личных вариантов ДНК-РНК гибридизации. Для генов с высоким
уровнем транскрипции могут быть пригодны дот или слот блоты
(см.Главу I). Когда источником РНК служат клетки, которые не
могут быть получены в большом количестве, используют цитоп-
лазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют, и
фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых про-
водят гибридизацию. Значительно большой чувствительностью
обладает, так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гиб-
ридизация с ДНК- зондами на фильтрах предварительно скон-
центрированных и фракционированных путем электрофореза моле-
кул РНК (Sambrook et al., 1987). Электрофорез проводят в
агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В
этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель
находится в логарифмической зависимости от длины последова-
тельности, что позволяет точно определить размер РНК
транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде
двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосо-
мальной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы
в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой
отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибри-
дизации с соответствующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то
преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены мо-
лекулы РНК, дающие перекрестную гибридизацию с ДНК-зондом.
Кроме того, характер электрофоретического разделения позво-
ляет визуально оценить качество изолированной РНК. При очень
низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях,
когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими
компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной
тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках
фракций, содержащих поли-A "хвосты". Для этого выделенную
РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-T
олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентра-
цией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, со-
держащие поли -A "хвосты", задерживались на колонке. При
снижении концентрации солей в буфере происходит расплавление
A-T дуплексов и высвобождение молекул мРНК. Таким способом
доля этих молекул в определенных солевых фракциях может быть
увеличена на два порядка. Конечно, поли-A селекция применима
в тех случаях, когда имеется достаточно большое количество
тотальной РНК. Другим методом для исследования структуры РНК
транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК гиб-
ридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1 нуклеазу для
переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так
и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуп-
лексов, которые затем элюируют из геля для последующего ана-
лиза (Sambrook et al.,1989). Этот метод очень удобен для
анализа стартовых сайтов и 3'-концов генов, для определения
направления транскрипции и картирования интронов.
Уровень мРНК в клетке определяется несколькими кинети-
ческими параметрами - скоростью первичного синтеза, эффек-
тивностью процессинга РНК-транскриптов и периодом полураспа-
да зрелых молекул мРНК. Последний параметр определяют по ди-
намике исчезновения мРНК после добавления к клеткам актино-
мицина D, специфическим образом супрессирующего транскрип-
цию.
Исследование механизмов транскрипции и процессинга пер-
вичных РНК-транскриптов проводят in vitro с использованием
искусственным образом сконструированных транскрипционных
систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;
Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс,Хиггинс, 1987). Для
этого могут быть выбраны два различных подхода. В первом
случае изолируют ядра и в качестве транскрипционной матрицы
используют неповрежденный хроматин. Синтез РНК проводят с
добавлением всех необходимых реагентов и, в частности, три-
фосфатов, в один из которых (обычно в урацил) вводят ради-
оактивную метку. При этом вновь синтезированные молекулы РНК
оказываются мечеными. Выбор специфических молекул РНК прово-
дят путем ДНК-РНК гибридизации, однако, в отличие от ранее
описанных методов анализа мРНК, используют немеченые
кДНК-зонды, предварительно нанесенные на фильтры. Большим
достоинством этой транскрипционной системы является ее
максимальная приближенность к естественным процессам. При
втором подходе транскрипция ведется с клонированных фрагмен-
тов ДНК, а ядерные экстракты служат источником ферментов и
регуляторных белков.
Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе-
мы.
Традиционные методы анализа регуляции трансляции и
посттрансляционных модификаций белков основаны на использо-
вании модельных систем, представляющих собой цитоплазмати-
ческие свободные от мРНК безядерные экстракты клеток, содер-
жащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор амино-
кислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга
белков (Хэймс, Хиггинс, 1987; Клеменс, 1987 ). После добав-
ления к такой системе специфической мРНК происходит синтез
соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении
меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки
после электрофоретической очистки могут быть идентифицирова-
ны путем радиоавтографии либо иммунологическими методами,
при наличии соответствующих антител (Клеменс, 1987). Однако,
для значительного числа моногенных наследственных заболева-
ний первичный биохимический дефект неизвестен, а следова-
тельно, не идентифицированы и мРНК транскрипты. Биохими-
ческое изучение многих белков затруднено из-за их минорного
содержания и отсутствия эффективных методов выделения и
очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере от-
носится к нерасворимым белкам, ассоциированным с мембранными
структурами клеток.
ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культу-
ры, синтезирующие чужеродные белки, являются очень мощным
средством анализа структуры, функции и синтеза белков
(Sambrook et al., 1989). Такие системы конструируют на осно-
ве экспрессионных векторов, содержащих в своем составе силь-
ные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечива-
ющие высокий, но в то же время регулируемый уровень
экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов
инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-ин-
женерных приемов в область действия этих промоторов. Конеч-
но, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы,
в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу
рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях
экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным ге-
нам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию
чужеродных белков в клетках.
Существует три типа экспрессионных систем - бактериаль-
ные, сконструированные обычно на основе E.coli, дрожжевые и
экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих
систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные
системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122519 прочтено)