Книга по генетике

Страница: 17/52

в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.

Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как

непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно-

вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:

Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма

в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в

положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у

60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин

и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли-

фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей

детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection

(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации

(Montadont et al.1990).

Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко-

вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных

биологических моделей способствовали быстрому прогрессу

исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее

время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-

ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в

опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных

системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве-

дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в

первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали

экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.

После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы-

шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся

в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et

al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена

трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком-

бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При

этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение

более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер-

тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об

успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным

мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич-

ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo

рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный

скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа-

листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи-

лии В - событие самого ближайшего будущего.

10.4.5 Болезнь Виллебранда.

Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некото-

рых формах рецессивное) заболевание, обусловленное

наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору

VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как

фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру-

ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК

составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров

с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.

Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосу-

дов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах поврежде-

ния эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции син-

теза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фак-

тора VIII.

Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и

III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концент-

рация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.

Генетически эта форма заболевания подразделяется на ре-

цессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессив-

ны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора

VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать

большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении ско-

рости их выведения из плазмы (тип IIB).

Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов,

размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величи-

на интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000

пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются

первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица

VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35

экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся после-

довательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA

повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены,

кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На

хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб,

соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,

1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс му-

тации препятствуют образованию функционального транскрипта.

Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II

болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены

аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций

в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,

1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA

кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован

сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе

IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитар-

ным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая

группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сег-

менте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного

изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях.

При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи-

лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма-

лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с

фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру-

ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую-

щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС

(Mazurier, 1992).

Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо-

левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.

Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози-

готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в

одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом

же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки

считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци-

тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута-

ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон

Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов-

ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде

с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между

геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).

Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо-

лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра-

вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг-

ностики и результатами медико-генетического консультирова-

ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле-

дования заболевания в семье высокого риска и установить его

форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,

а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа-

ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с

тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве-

ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются

экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et

al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не

обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся

(Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспек-

тивной на современном этапе представляется непрямая диаг-

ностика. В промоторной части гена, в интронах

15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти-

фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с

достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек-

тивным для диагностики является полиморфизм интрона

40, представляющий собой две области варьирующих по числу

тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика-

ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с

последующим электрофоретическим разделением позволяет иден-

тифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма

(Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволя-

ет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому

(ген) и проследить её передачу в потомстве.

Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступ-

ной литературе не обнаружены.

10.4.6 Фенилкетонурия.

Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосом-

но-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным де-

фектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии

своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Ев-

ропе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -

17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ

достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).

Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России

частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.

Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевремен-

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125166 прочтено)