Страница: 17/52
в одном случае им не удалось идентифицировать мутацию.
Молекулярная диагностика гемофилии В проводится как
непрямыми так и прямыми методами. Непрямая диагностика осно-
вана на анализе методом ПЦР внутригенных полиморфных сайтов:
Taq1 (в положении 11 109-11 113); инсерционного полиморфизма
в интроне А (рестриктазы Hinf1 и Dde1) ; Taq1 в интроне F в
положении 72. Метод ПДРФ анализа информативен только у
60-70% всех семей с гемофилией В (Aseev et al., 1994; Сурин
и др., 1994). Прямая диагностика гемофилии В включает ампли-
фикацию геномных фрагментов гена фактора IX с последующей
детекцией ошибок комплементации методом mismatch detection
(см.Главу IV) и прямое секвенирование продуктов амплификации
(Montadont et al.1990).
Сравнительно небольшие размеры гена, присутствие белко-
вого генопродукта в сыворотке крови и наличие естественных
биологических моделей способствовали быстрому прогрессу
исследований по генотерапия гемофилии В, которая в настоящее
время уже включена в программы клинических испытаний. Успеш-
ная трансдукция и коррекция генетического дефекта получена в
опытах in vitro и in vivo на самых различных модельных
системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при вве-
дении полноразмерной кДНК в составе ретровирусного вектора в
первичные культуры кератиноцитов человека наблюдали
экспрессию F9 и секрецию биологически активного фактора IX.
После трансплантации этих трансдуцированных клеток nu/nu мы-
шам человеческий фактор IX в небольшом количестве появлялся
в кроветоке и сохранялся там в течение недели (Gerrard et
al.,1993). На собаках, страдающих гемофилией B, осуществлена
трансдукция гепатоцитов in vivo путем прямой инфузии реком-
бинантного ретровирусного вектора в портальную вену. При
этом наблюдали устойчивую экспрессию фактора IX в течение
более 5 месяцев и улучшение биохимических показателей свер-
тываемости крови (Kay et al.,1993). Имеется сообщение об
успешной коррекции гемофилии В в Китае в 1992г. Двум больным
мальчикам в кожу спины трансплантировали культуру аутологич-
ных фибробластов, предварительно трансдуцированных ex vivo
рекомбинантной кДНК гена FVIII. Несмотря на определенный
скептицизм в оценке этого достижения со стороны специа-
листов, нет сомнения в том, что успешная генотерапия гемофи-
лии В - событие самого ближайшего будущего.
10.4.5 Болезнь Виллебранда.
Болезнь Виллебранда- аутосомно-доминантное (при некото-
рых формах рецессивное) заболевание, обусловленное
наследственным дефицитом белка VIIIR, родственного фактору
VIIIС свертывания крови (см.Гемофилия А) и известного, как
фактор фон Виллебранда. Этот большой гликопротеин синтезиру-
ется клетками эндотелия, в которых специфическая YIIIR-мРНК
составляет 0.3%, и поступает в кровь в виде двух мультимеров
с молекулярными весами от 850 кД до 20 миллионов дальтон.
Фактор VIIIR осуществляет взаимодействие между стенкой сосу-
дов и тромбоцитами, регулируя их адгезию в местах поврежде-
ния эндотелия. Фактор VIIIR участвует также в регуляции син-
теза и секреции фактора YIIIC и стабилизирует комплекс фак-
тора VIII.
Различают 7 типов болезни Виллебранда - I, IIA-IIE и
III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типе I снижена концент-
рация всех мультимеров в плазме, но их качество не нарушено.
Генетически эта форма заболевания подразделяется на ре-
цессивные и доминантные варианты. Типы IIC и III - рецессив-
ны. Тип II характеризуется качественными аномалиями фактора
VIIIR, выражающимися в уменьшении способности формировать
большие мультимеры, (типы IIA и IIC) или в увеличении ско-
рости их выведения из плазмы (тип IIB).
Ген F8VWF достаточно протяженный и состоит из 52 экзонов,
размерами от 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величи-
на интронов варьирует в огромных пределах (от 100 до 20 000
пар нуклеотидов). Сигнальный пептид и пропептид кодируются
первыми 17 экзонами, в то время как зрелая субьединица
VIIIR- фактора и 3'нетранслируемая область - остальными 35
экзонами. Внутри гена идентифицированы повторяющиеся после-
довательности, включая 14 Alu-элементов и полиморфный TCTA
повтор размером около 670 п.о. в интроне 40. Районы гены,
кодирующие гомологичные домены, имеют сходную структуру. На
хромосоме 22q11-q13 обнаружен псевдоген длиной 21-29 кб,
соответствующий экзонам 23-34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,
1991). Идентифицированные в нем сплайсинговые и нонсенс му-
тации препятствуют образованию функционального транскрипта.
Наибольшее число мутаций идентифицировано при типе II
болезни Виллебранда. Подавляющее большинство из них - замены
аминокислот, чаще всего происходящие в результате транзиций
в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,
1991; Donner et al., 1992). Мутации при болезни типа IIA
кластерированы в A2 домене, где предположительно локализован
сайт протеолетического отщепления, в то время, как при типе
IIB - в домене, обеспечивающим взаимодействие с тромбоцитар-
ным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Большая
группа мутаций при форме заболевания IIB локализована в сег-
менте из 11 аминокислот внутри единственного дисульфидного
изгиба (loop), соединяющего цистеины в 509 и 695 положениях.
При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи-
лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма-
лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с
фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру-
ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую-
щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС
(Mazurier, 1992).
Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо-
левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.
Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози-
готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в
одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом
же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки
считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци-
тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута-
ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон
Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов-
ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде
с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между
геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).
Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо-
лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра-
вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг-
ностики и результатами медико-генетического консультирова-
ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле-
дования заболевания в семье высокого риска и установить его
форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,
а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа-
ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с
тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве-
ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются
экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et
al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не
обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся
(Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспек-
тивной на современном этапе представляется непрямая диаг-
ностика. В промоторной части гена, в интронах
15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти-
фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с
достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек-
тивным для диагностики является полиморфизм интрона
40, представляющий собой две области варьирующих по числу
тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика-
ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с
последующим электрофоретическим разделением позволяет иден-
тифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма
(Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволя-
ет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому
(ген) и проследить её передачу в потомстве.
Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступ-
ной литературе не обнаружены.
10.4.6 Фенилкетонурия.
Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосом-
но-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным де-
фектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии
своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Ев-
ропе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -
17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ
достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).
Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России
частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.
Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевремен-
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122325 прочтено)