Книга по генетике

Страница: 44/52

родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию

нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк-

лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с

уже известными наследственными нарушениями у человека и по-

добные животные также могут использоваться в качестве гене-

тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для

получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых

решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем

трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре-

нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи-

ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо-

вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно

(Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до-

полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше-

нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс-

твие этого, было причиной патологических процессов.

Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.

Другой вариант биологического моделирования основан на

получении животных с определенными очень специфичными, но

ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть

использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и

разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько

примеров подобного экспериментального моделирования.

Описанная технология трансгеноза (введение генов в про-

нуклеус) может быть использована, в частности, для направ-

ленного получения животных с избирательными дефектами

(уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает-

ся в возможности селективной элиминации тех специфических

типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с

моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть

получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа-

щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий-

ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде-

ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива-

ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз-

вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной

гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая

система действует как очень точный скальпель.

Дальнейшая модификация метода заключается в использова-

нии для трансгеноза условно летального гена, каким является,

например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки,

экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормаль-

но. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно

вызвать их селективную гибель при введении животному ганцик-

ловира - противогерпесного препарата. Эта система дает боль-

ше возможностей для экспериментального анализа роли специфи-

ческих клонов клеток в процессе нормального развития, а так-

же для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью

этих клеток. Подобная методология используется также при

разработке генотерапевтических подходов для лечения некото-

рых ненаследственных, в частности онкологических заболева-

ний (см Главу IX).

Весьма многообещающим методом моделирования представля-

ется направленное выключение работы определенных генов путем

введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.

Такой подход был применен, в частности, при попытке модели-

рования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловлен-

ного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).

Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена

носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, явля-

ется само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.

Другой пример экспериментального моделирования основан

на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным

мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса

и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор-

жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у

таких животных может происходить дифференцировка трансплан-

тированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пе-

ресаженных кусочков тканей из различных органов других видов

животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с

нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека,

имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют струк-

туру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется

в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак-

тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариан-

тов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эф-

фективности коррекции этого генетического дефекта с помощью

методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпители-

альные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали

трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, не-

сущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК

нормального гена муковисцидоза. Относительная простота по-

добных моделей и возможность генетического манипулирования с

клетками человека до их трансплантации атимусным мышам дела-

ют этот подход весьма привлекательным для решения многих

экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моде-

лей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных

мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии жи-

вотных в этом отношении имеют значительные преимущества.

Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-

ний животных.

Современный уровень экспериментальной эмбриологии мле-

копитающих и современные достижения молекулярной генетики

позволяют осуществлять направленное получение генетических

моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфи-

ческих модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный

качественный прорыв в генетическом моделировании стал возмо-

жен благодаря появлению принципиально новой технологии мани-

пулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно

важными в этом отношении оказались два новых методических

подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных

клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в

полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии

культивирования клеточных векторов, так называемых эмбрио-

нальных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой

стороны, появились методы сайт-специфического переноса кло-

нированных последовательностей ДНК в геном эукариот, осно-

ванные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфек-

ции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте

геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности

ДНК в месте встраивания.

Конструированию генетических моделей должны предшество-

вать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологич-

ных генов - гена человека, вследствие нарушения работы кото-

рого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у

выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта

моделирования, в первую очередь, руководствуются методичес-

кими возможностями экспериментального манипулирования с жи-

вотными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей

гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В

большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным

обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирова-

ния генетической линии животных с мутациями в заданном гене

предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть

способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмб-

риональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомби-

нантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного

переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры

эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и от-

бором клонов со специфическими генетическими модификациями;

(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на

стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения хи-

мерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не-

сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;

(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7)

инбредное разведение и селекцию гомозигот (Рис.8.1).

Как упоминалось ранее, идеальной системой для направ-

ленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмб-

риональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;

Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры

этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней кле-

точной массы) или из первичных половых клеток ранних пос-

тимплантационных зародышей. При выращивании на питательном

слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недиф-

ференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом

они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери

способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель

(полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и мо-

гут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио-

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125144 прочтено)