Страница: 44/52
родной ДНК нередко индуцирует мутации и нарушает экспрессию
нормальных генов реципиента. В ряде случаев наблюдаемые отк-
лонения в развитии оказываются аналогичными или сходными с
уже известными наследственными нарушениями у человека и по-
добные животные также могут использоваться в качестве гене-
тических моделей заболеваний. Этот подход был применен для
получения моделей таких заболеваний, в патогенезе которых
решающую роль играет эффект дозы генов. В частности, путем
трансфекции зиготы мышей генами бета-глобина, коллагена, ре-
нина, антигенов гистосовместимости удалось получить биологи-
ческие модели таких заболеваний, как бета-талассемия, несо-
вершенный остеогенез, гипертония и диабет, соответственно
(Erickson, 1988). Во всех перечисленных случаях введение до-
полнительной дозы экспрессирующего гена приводило к наруше-
нию балланса белковых генопродуктов в клетках и, как следс-
твие этого, было причиной патологических процессов.
Раздел 8.3. Экспериментальное моделирование.
Другой вариант биологического моделирования основан на
получении животных с определенными очень специфичными, но
ненаследственными изменениями. Эти животные также могут быть
использованы для анализа молекулярных основ патогенеза и
разработки методов адекватного лечения. Рассмотрим несколько
примеров подобного экспериментального моделирования.
Описанная технология трансгеноза (введение генов в про-
нуклеус) может быть использована, в частности, для направ-
ленного получения животных с избирательными дефектами
(уродствами) тех или иных тканей и органов. Метод заключает-
ся в возможности селективной элиминации тех специфических
типов клеток, которые отсутствуют или дефектны у больных с
моделируемым типом заболевания. Такие животные могут быть
получены при иньекции в зародыш рекомбинантной ДНК, содержа-
щей какой-либо цитотоксический ген, например, ген дифтерий-
ного токсина, находящийся под контролем работающих в опреде-
ленных типах клеток регуляторных элементов ДНК. При актива-
ции этих контролирующих элементов на определеной стадии раз-
вития экспрессия токсического гена приводит к избирательной
гибели всей специфической популяции клеток, то есть такая
система действует как очень точный скальпель.
Дальнейшая модификация метода заключается в использова-
нии для трансгеноза условно летального гена, каким является,
например, ген тимидинкиназы вируса Герпеса. Клетки,
экспрессирующие этот ген, функционируют совершенно нормаль-
но. Однако, на любой стадии онтогенетического развития можно
вызвать их селективную гибель при введении животному ганцик-
ловира - противогерпесного препарата. Эта система дает боль-
ше возможностей для экспериментального анализа роли специфи-
ческих клонов клеток в процессе нормального развития, а так-
же для изучения патологичеких процессов, связанных с гибелью
этих клеток. Подобная методология используется также при
разработке генотерапевтических подходов для лечения некото-
рых ненаследственных, в частности онкологических заболева-
ний (см Главу IX).
Весьма многообещающим методом моделирования представля-
ется направленное выключение работы определенных генов путем
введения в доимплантационные зародыши антисмысловых мРНК.
Такой подход был применен, в частности, при попытке модели-
рования болезни Гоше - лизосомного заболевания, обусловлен-
ного дефицитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).
Естественно, что в этом случае выключение экспрессии гена
носит транзиторный характер, то есть моделью, по-сути, явля-
ется само животное - реципиент антисмысловой мРНК матрицы.
Другой пример экспериментального моделирования основан
на пересадке тканей или клеток атимусным иммунодефицитным
мышам nu/nu. У мышей этой линии в связи с отсутствием тимуса
и выраженным врожденным иммунодефицитом не происходит оттор-
жение трансплантированных чужеродных тканей. Более того, у
таких животных может происходить дифференцировка трансплан-
тированных подкожно эмбриональных зачатков и регенерация пе-
ресаженных кусочков тканей из различных органов других видов
животных и человека. Так например, кусочки трахеи крысы с
нанесенными на них клетками бронхогенного эпителия человека,
имплантированные подкожно атимусным мышам, формируют струк-
туру поверхностного эпителия, сходную с той, которая имеется
в бронхах человека. Именно таким путем мыши nu/nu были ак-
тивно использованы для анализа экспрессии мутантных вариан-
тов гена муковисцидоза человека, а также для испытания эф-
фективности коррекции этого генетического дефекта с помощью
методов генотерапии. В последнем случае мутантные эпители-
альные клетки пациентов с муковисцидозом вначале подвергали
трансфекции ретровирусными или аденовирусными векторами, не-
сущими, наряду с геном - репортером, полноразмерную кДНК
нормального гена муковисцидоза. Относительная простота по-
добных моделей и возможность генетического манипулирования с
клетками человека до их трансплантации атимусным мышам дела-
ют этот подход весьма привлекательным для решения многих
экспериментальных вопросов. Основные недостатки таких моде-
лей связаны с трудностями содержания и разведения атимусных
мышей и их низкой жизнеспособностью. Генетические линии жи-
вотных в этом отношении имеют значительные преимущества.
Раздел 8.4. Конструирование модельных генетических ли-
ний животных.
Современный уровень экспериментальной эмбриологии мле-
копитающих и современные достижения молекулярной генетики
позволяют осуществлять направленное получение генетических
моделей наследственных болезней путем введения сайт-специфи-
ческих модификаций в геном млекопитающих. Такой значительный
качественный прорыв в генетическом моделировании стал возмо-
жен благодаря появлению принципиально новой технологии мани-
пулирования с ранними зародышами млекопитающих. Особенно
важными в этом отношении оказались два новых методических
подхода: получение зародышей-химер, состоящих из клеточных
клонов разных зигот, путем введения тотипотентных клеток в
полость бластоцисты (Gardner, 1978) и разработка технологии
культивирования клеточных векторов, так называемых эмбрио-
нальных стволовых клеток (Evans, Kaufman, 1981). С другой
стороны, появились методы сайт-специфического переноса кло-
нированных последовательностей ДНК в геном эукариот, осно-
ванные на отборе клеточных клонов, в которых после трансфек-
ции происходит инсерция экзогенной ДНК в гомологичном сайте
геномной ДНК без какого-либо нарушения последовательности
ДНК в месте встраивания.
Конструированию генетических моделей должны предшество-
вать идентификация и сравнительный анализ двух гетерологич-
ных генов - гена человека, вследствие нарушения работы кото-
рого развивается моделируемое заболевание, и его гомолога у
выбранного для моделирования животного. При выборе обьекта
моделирования, в первую очередь, руководствуются методичес-
кими возможностями экспериментального манипулирования с жи-
вотными. Важное значение имеет сходство кодирующих областей
гетерологичных генов по нуклеотидным последовательностям. В
большинстве случаев мыши представляются наиболее удобным
обьектом для моделирования. Современный алгоритм формирова-
ния генетической линии животных с мутациями в заданном гене
предполагает: (1) наличие культур тотипотентных, то есть
способных к неограниченному развитию и дифференцировке, эмб-
риональных стволовых клеток; (2) создание на базе рекомби-
нантных ДНК генно-инженерных конструкций для направленного
переноса генов; (3) трансфекцию этих конструкций в культуры
эмбриональных стволовых клеток последующим скринингом и от-
бором клонов со специфическими генетическими модификациями;
(4) введение отобранных модифицированных клеток в зародыш на
стадии бластоцисты по методу Гарднера с целью получения хи-
мерных трансгенных животных; (5) отбор химерных особей, не-
сущих модифицированные гены в различных тканях и органах;
(6) селекцию особей, гетерозиготных по данной мутации; (7)
инбредное разведение и селекцию гомозигот (Рис.8.1).
Как упоминалось ранее, идеальной системой для направ-
ленного переноса мутаций в геном млекопитающих являются эмб-
риональные стволовые клетки - ЭСК (Evans, Kaufman, 1981;
Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первичные культуры
этих клеток получают из клеток бластоцисты (внутренней кле-
точной массы) или из первичных половых клеток ранних пос-
тимплантационных зародышей. При выращивании на питательном
слое из эмбриональных фибробластов ЭСК сохраняются в недиф-
ференцированном состоянии от трех месяцев до года. При этом
они могут быть несколько раз заморожены и оттаяны без потери
способности к дифференцировке. ЭСК, введенные в бластоцель
(полость бластоцисты), сохраняют свою тотипотентность и мо-
гут участвовать в формировании, практически, всех эмбрио-
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122323 прочтено)