Страница: 15/52
Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и
протяженностью делеции не отмечается, но различия между фор-
мами Дюшенна и Беккера, в общем случае, связаны с наличием
или отсутствием сдвига рамки считывания. Ген дистрофина мо-
жет быть вовлечен также в другие структурные перестройки -
дупликации, транслокации. Так, примерно 5% мутаций гена
дистрофина составляют дупликации и около 35%-точечные мута-
ции, преимущественно, микроделеции (от 1 до нескольких нук-
леотидов), а также нонсенс мутации. Относительно высокий
процент нонсенс мутаций в гене дистрофина связывают с
присутствием большого количества глютаминовых триплетов, му-
тации в котором часто приводят к образованию стоп-кодона.
Крайне редки миссенс мутации. Считается, что в 30% семей с
МД и МБ мутации спонтанного происхождения и возникают преи-
мущественно в оогенезе, в остальных семьях это наследствен-
ные формы.
Разработаны очень эффективные методы диагностики деле-
ций в DMD-гене, основанные на мультиплексной ПЦР. Одновре-
менное тестирование 18 экзонов + промоторной части гена поз-
воляет выявить до 98% всех крупных делеций гена (Baranov et
al., 1993). Для обнаружения гетерозиготного носительства де-
леций используется метод RT PCR, то есть изоляция эктопи-
ческой DMD-мРНК из клеток крови, обратная транскрипция, амп-
лификация кДНК, рестрикционный анализ и секвенирование
(Roberts et al.,1991). Для этой же цели применяется метод
иммунодетекции мутантного белка в белковом лизате мышц и на
гистологических срезах биоптатов мышц (Arahata et
al.,1989). При отсутствии идентифицируемой делеции применяют
косвенный метод ДНК-диагностики с использованием внутриген-
ных полиморфных сайтов: pERT87-8/Taq1; pERT87-15/BamH1;
124/Pst1;16intron/ Taq1, и аллельных вариантов динуклеотид-
ных СА повторов в интронах 49 и 50 - STR-49; STR-50 (Малыше-
ва и др., 1991; 1992; Евграфов, Макаров, 1987; Евграфов и
др., 1990).
Серьезную проблему для диагностики гетерозиготного
носительства и, следовательно, для медико-генетического
консультирования предствляют случаи, так называемого, гонад-
ного мозаицизма - присутствие в соматических клетках гонад
женщины-неносительницы мутаций гена дистрофина, что, в свою
очередь, приводит к появлению нескольких генераций (клонов)
половых клеток (ооцитов) с мутанынм и нормальным генами
дистрофина. Предполагается, что такие мутации могут возни-
кать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ран-
них стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ори-
ентировочным оценкам примерно 6-7% всех спорадических случа-
ев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оце-
нить величину аберрантного клона ооцитов практически не
представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении
здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери
больного МД не удается определить гетерозиготное носительст-
во, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при нали-
чии спорадического случая рождения ребенка с МД и при
отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного
носительства мутации гена дистрофина у матери риск повторно-
го рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et
al.,1992).
У многих пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногисто-
химическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистро-
фин-положительные волокна. Однако, при использовании антител
с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным
участком гена, окрашивания не происходит и это позволяет от-
вергнуть гипотезу соматического мозаицизма. Наиболее вероят-
ный механизм такого явления - возникновение второй сомати-
ческой делеции в мышечных клетках, устраняющей сдвиг рамки
считывания, вызванный основной делецией. В результате му-
тантный ген может транскрибироваться с образованием стабиль-
ного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al.,1992).
Имеется модельная линия мышей с миодистрофией Дюшенна -
mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации,
спонтанно возникшей в C57BL/10 линии (Bulfield et al.,
1984). В мышцах и в мозгу у мышей этой линии обнаруживается
резко сниженное количество Dmd-мРНК, однако дистрофин пол-
ностью отсутствует. Несмотря на это, никаких видимых клини-
ческих аномалий у mdx-мышей не наблюдаются. Идентифицирована
нонсенс мутация в mdx-гене, в результате которой у мышей
транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. Обнаруже-
на также сплайсинговая мутация, приводящая к вырезанию экзо-
на 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).
В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципи-
альная возможность генокоррекции МД. Появление дистрофина
человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали
после введения ретровирусных или аденовирусных генноинженер-
ных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена дистро-
фина (14 кб) или его делетированную, но функционально актив-
ную форму, так называемый мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,
1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). После внутри-
венного введения фрагментов Dmd-гена в составе рекомбинант-
ного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной
ДНК в скелетных и сердечных мышцах животных
(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Несмотря на эти оче-
видные успехи, проблема генноинженерной коррекции МД еще да-
лека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты
исследователей о перспективности генной терапии МД по срав-
нению с клеточной терапией (пересадка здоровых эмбриональных
миобластов). Пока не утверждена ни одна программы клини-
ческих испытаний генотерапевтического подхода МД (см.Главу
IX). Основная сложность проблемы генокоррекции - необходи-
мость обеспечения системы эффективной доставки гена дистро-
фина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особен-
но важно - в мышцы сердца и диафрагмы. В 1995г. исследования
по генотерапии МД начаты в рамках программы Геном человека и
в нашей стране.
10.4.3 Гемофилия А.
Гемофилия А - сцепленное с полом заболевание, вызванное
наследственным дефектом фактора VIII, важнейшего звена в
системе свертывания крови (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора
YIII с молекулярным весом более 1 миллиона состоит из 2-х
компонентов. Главный компонент - YIIIC, кодируется геном
F8C, локализованным в X-хромосоме. С YIIIC нековалентно свя-
зан фактор Виллебранда - YIIIR, кодирующийся аутосомным ге-
ном. Фактор Виллебранда стабилизирует фактор VIII и регули-
рует его активность.
Ген F8C - одним из очень крупных генов человека; содер-
жит 26 экзонов (размером от 69 до 3106 нуклеотидов). Общая
длина интронов соствляет 177 кб; около 20% этой ДНК прихо-
дится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С размером 9 009
нуклеотидов включает 5'нетранслируемую последовательность
(150 п.о.), 3'нетранслируемую последовательность (1 806
п.о.) и кодирующий фрагмент (7053 п.о.). Внутри гена F8 в
интроне 22 локализовано еще два других структурных гена не-
известной природы - F8А и F8В, что было обнаружено методами
молекулярный анализ. Ген F8A, целиком локализованный в инт-
роне 22 гена F8C, не содержит интронов и транскрибируется в
направлении, противоположном фактору VIII (3'-5'). Первый
экзон гена F8B также расположен в интороне 22, а следующие
его области распределены до экзонов 23-26; транскрибируется
он в том же направлении, что и ген F8C (5'-3'). Оба гена
экспрессируются во всех тканях (Levinson et al.,1990;
Freije,Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22
оказался необычным и в том отношении, что содержит CpG-ост-
ровок на расстоянии около 10 кб от экзона 22 - предположи-
тельное место локализации бинаправленного промотора для ге-
нов F8A и F8B. Оказалось, что на расстоянии примерно 500 кб
в 5-'направлении от гена F8 находятся еще 2 транскрибируемые
копии гена F8A (Lakich et al.,1993).
Во время процессинга первичного белкового продукта гена
F8C от исходного пептида из 2 351 аминокислотных остатка от-
щепляется последовательность в 335 аминокислотных остатка. В
плазме крови фактор VIII существует в виде металлозависимого
гетеродимера, состоящего из С-концевой легкой цепи (80 кД) и
N-концевой тяжелой цепи (200 кД). Половина всех больных с
гемофилией A не имеют фактора VIII, 5%- имеют нормальное ко-
личество нефункционирующего белка и в остальных случаях ак-
тивность белка сохранена, но его количество резко снижено
(McGinnis et al.,1993).
Изолированные случаи гемофилии A составляют 30%; 70% -
семейные варианты. Показано, что мутации в гене F8 возникают
в сперматогенезе в 3 - 5 раз чаще, чем в оогенезе (Rosendaal
et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Это означает,
что в 80-86% спорадических случаев матери являются носителя-
ми мутации, возникшей в зародышевых клетках их отца. Кроме
того, около 14% матерей, не являющихся носителями мутации,
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122512 прочтено)