Книга по генетике

Страница: 26/52

ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-

концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой

нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между

праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка-

честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип

ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов

про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери-

альных клонов, библиотек генов или из других источников. Для

проведения специфической амплификации не требуется больших

количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной

молекулы ( Li et al., 1988). Успех в разработке метода ПЦР в

значительной мере связан с использованием в качестве фермен-

та, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы,

выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и по-

тому устойчивой к действию высоких температур (Kogan et al.,

1987).

Принципиальная схема полимеразной цепной реакции пока-

зана на Рис.1.10. На первом этапе исследуемая двухнитевая

матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее наг-

ревания в течение нескольких минут до температуры, превышаю-

щей +95 - +98 С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно

проста и заключается в чередовании циклов (1) гибридизации

или отжига ДНК с праймерами, (2) синтеза последовательности,

комплементарной матричной ДНК, и (3) денатурации образовав-

шихся двухнитевых структур. При гибридизации, достигаемой за

счет понижения температуры реакционной смеси до +30 - + 50

С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго

специфичных областях, комплементарных праймерам. При темпе-

ратуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы - +60 - +70 С,

начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого

участка, образованного праймерами. Затем при нагревании

раствора примерно до +80 - +90 С синтез прекращается и двух-

нитевой участок между матричными и вновь синтезированными

молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле

олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а за-

тем в последующих циклах и с вновь синтезированными молеку-

лами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем слу-

чае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного

режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифициро-

ванного участка, что и определяет, в кончном счете, размер

вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного

нуклеотида.

Таким образом, при каждом цикле происходит двухкрат-

ное увеличение числа синтезированных копий выбранного для

амплификации участка ДНК и содержание продуктов амплификации

в растворе нарастает в геометрической прогрессии. Каждая из

процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой

реакции и ее длительностью, меняющейся в диапозоне от десят-

ков секунд до 1 - 3 минут, так что полный цикл длится

от одной до несколько минут. За 25 - 30 циклов число синте-

зированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР

обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого

специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК.

Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и

выбирать оптимальные временные и температурные параметры для

каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы

возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень

проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопрайме-

ры, смесь трифосфатов и термофильную ДНК полимеразу добавля-

ют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают

небольшой обьем вазелинового масла для предотвращения раст-

вора от высыхания, затем помещают пробирку с реакционной

смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую

программу циклической смены температуры и длительности каж-

дого шага реакции. Общий обьем реакционной смеси, обычно,

составляет от 10 до 50 - 100 микролитров. Выбор оптимального

режима работы определяется длиной и специфичностью амплифи-

цируемого участка. Следует подчеркнуть, что, реально, для

каждой полимеразной реакции в звисимости от типа праймеров,

длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первич-

ной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой

термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и

состав амплификационной смеси могут существенно варьировать

и зачастую подбираются эмпирически.

С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места

локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а

также изучать наличие любых других специфических особен-

ностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на

основании анализа нуклеотидной последовательности амплифици-

руемого участка. Разработаны различные варианты автомати-

ческого поиска последовательностей ДНК, использование кото-

рых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации

специфического участка геномной ДНК. Для того, чтобы гибри-

дизация проходила строго специфично, праймеры не должны со-

держать повторяющихся последовательностей ДНК. Мы уже отме-

чали, что для проведения ПЦР достаточно минимального коли-

чества ДНК, вплоть до одной молекулы. Кроме того, различные

органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, уг-

леводы, фрагменты клеточных органелл или мембран заметно не

препятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве

источника матричной ДНК может быть использован любой, даже

деструктурированный биологический материал, сохранивший в

своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных

молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищен-

ной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна

крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины

хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, куль-

туры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие не

прикрепившиеся и не давшие роста клетки, соскребы с цитоге-

нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен-

ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши-

еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более

подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде

специальных руководств и инструкций.

Существуют различные модификации ПЦР, которые исполь-

зуются в зависимости от конкретных целей проведения реакции

или от характера последующего молекулярного анализа амплифи-

катов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержа-

щих различные повторяющиеся последовательности или необычные

структурные элементы), а также в тех случаях, когда матрич-

ная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в

два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором

этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации,

продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих

случаях для повышения специфичности праймирования используют

систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров,

то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают

последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в

первом раунде участка ДНК.

В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР,

то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат-

ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в

реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания зас-

луживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК.

На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии

генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить,

что реакцию амплификации можно проводить не только в раство-

рах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при

этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты

амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементар-

ные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase

reaction in situ). До настоящего времени доступными амплифи-

кации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В

последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усо-

вершенствований (особый подбор праймеров, использование сра-

зу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специ-

ального температурного режима полимеразных циклов), возможно

проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В

частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со

вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et

al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократ-

но будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР,

так как этот метод по праву стал один из основных в молеку-

лярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;

Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).

Возможность очень точного и специфичного выбора участ-

ка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых мо-

лекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку-

лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125137 прочтено)