Книга по генетике

Страница: 40/52

лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы-

ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism

-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном-

ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро-

форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден-

тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест-

рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).

При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо-

реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения

ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот-

ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя

соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо-

нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на

электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам

фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест-

рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С

каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному

локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа-

ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае

возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест-

рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-

тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест-

рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак-

тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в

десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда-

ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по-

лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты

изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию

и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте

ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-

личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли-

ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо-

мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об-

ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в

нижней области геля, соответствующий более короткому фраг-

менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по-

лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в

верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,

тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).

ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,

если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер-

жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния

этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп-

лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в

исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента

не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа-

зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области

сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины

(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,

один из которых по длине будет соответствовать размеру амп-

лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же

суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова-

ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож-

ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных

варианта электрофореграмм.

Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по-

лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге-

нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон-

дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной

нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют

широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде-

ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих

собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят

ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име-

ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из

популяций аналогичные исследования проводят в других популя-

циях.

Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции

всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да-

же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге-

терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет

превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного

сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный

аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную

маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по-

лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).

Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.

Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо

более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными

сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель-

ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -

90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых

микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове-

ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они

достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро-

мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто-

ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро-

вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach

et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных

последовательностей различают варьирующие по числу тандемные

повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а

также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко-

полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме

превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,

1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по

числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -

ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с

контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et

al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно-

ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,

можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных

или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно-

типную коровую последовательность. Примером может служить

VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая

четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми

повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с

успехом используются для идентификации личности методом

ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у

двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным

локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно

меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR

найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо-

гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло-

гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В

последнее время многочисленные VNTR- последовательности об-

наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).

Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-

ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по-

мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен-

но удобны для такого скрининга геномные библиотеки,

сконструированные на основе предварительно фракционированных

по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие

фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате-

литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие

результаты были получены также при скринировании космидных

библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и

использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР

(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью

применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага

М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour

etal., 1990).

Одним из вариантов минисателлитных последовательностей

являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы

-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и

также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых

единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы

обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других

частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от

друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20

кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-

и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как

они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR

обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее

время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих

тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых

частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в

сторону их увеличения может приводить к нарушению функции

этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи-

Реферат опубликован: 26/04/2005 (125170 прочтено)