Страница: 40/52
лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы-
ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном-
ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро-
форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден-
тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест-
рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).
При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо-
реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения
ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот-
ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя
соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо-
нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на
электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам
фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест-
рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С
каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному
локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа-
ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае
возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест-
рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-
тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест-
рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак-
тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в
десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда-
ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по-
лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты
изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию
и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте
ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-
личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли-
ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо-
мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об-
ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в
нижней области геля, соответствующий более короткому фраг-
менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по-
лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в
верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,
тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,
если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер-
жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния
этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп-
лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в
исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента
не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа-
зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области
сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины
(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,
один из которых по длине будет соответствовать размеру амп-
лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же
суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова-
ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож-
ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных
варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по-
лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге-
нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон-
дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной
нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют
широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде-
ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих
собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят
ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име-
ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из
популяций аналогичные исследования проводят в других популя-
циях.
Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции
всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да-
же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге-
терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет
превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного
сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный
аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную
маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по-
лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо
более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными
сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель-
ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -
90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых
микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове-
ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они
достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро-
мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто-
ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро-
вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach
et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных
последовательностей различают варьирующие по числу тандемные
повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а
также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко-
полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме
превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,
1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по
числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -
ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с
контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et
al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно-
ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,
можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных
или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно-
типную коровую последовательность. Примером может служить
VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая
четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми
повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с
успехом используются для идентификации личности методом
ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у
двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным
локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно
меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR
найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо-
гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло-
гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В
последнее время многочисленные VNTR- последовательности об-
наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).
Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-
ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по-
мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен-
но удобны для такого скрининга геномные библиотеки,
сконструированные на основе предварительно фракционированных
по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие
фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате-
литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие
результаты были получены также при скринировании космидных
библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и
использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР
(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью
применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага
М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour
etal., 1990).
Одним из вариантов минисателлитных последовательностей
являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы
-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и
также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых
единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы
обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других
частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от
друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20
кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-
и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как
они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR
обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее
время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих
тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых
частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в
сторону их увеличения может приводить к нарушению функции
этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи-
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122516 прочтено)