Биотехнология, биопрепараты

Страница: 21/26

вторичную иммунизацию, используя половинную дозу иммуногена в

неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизируют подкожно в складку кожи

на шее. Через 10 суток делают пробное кровопускание и определяют

качество антисыворотки. При неудовлетворительном качестве инди-

видуальной антисыворотки иммунизируют новую группу кроликов или

животных другого вида. /6817/84/

32. Адсорбция (очистка) 0 и тестирование

- высаливание (осаждение сульфатом натрия или сульфатом ам-

мония)

- осаждение спиртом

- аффинной хроматографией

- обработкой полиэтиленгликолем

- каприловой кислотой

- выделение на белок А-сефарозе

33. Фракционирование 0

2II. MAT (in vitro).

Получение МАТ (гибридомная технология)

а) В-лимфоциты + вирус Эпштейна-Барра --- быстро перестают

синтезировать АТ

б) В-лимфоциты + миеломная лимфоцитарная клетка --- гибридо-

ма (под действием ПЭГа).

МАТ с запрограммированной специфичснотью впервые получили

аргентинец Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер (G.Koh-

ler) /Nature. - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что получили в

1978 году Нобелевскую премию. Они рассчитывали использовать

гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат при-

вел к подлинному буму.

В основу метода положен давно известный принцип гибридизации

(слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделе-

нием и культивированием необходимого гибридного клона. Для сли-

яния используют клетки двух видов. Первые - плазмоцитомы (опу-

холевые плазмоциты) из линий, культивируемых в искусственных

условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интен-

сивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки

- иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезиро-

вать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти

клетки существуют лишь несколько дней.

Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует

признаки обоих "родителей".

Получение гибридом включает 6 основных этапов.

1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам анти-

гена, против которого необходимо получать антитела.

2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с его же

опухолевыми клетками. Для соединения клеток используют обычно

полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностиные мембраны и спо-

собствующий соединению клеток.

3. Отбор гибридов. Клетки культивируют в среде, содержащей

гипоксантин. Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его

разрушающего, а лимфоциты - просто потому, что не умеют долго

поддерживать свое существование вне организма.

4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вы-

рабатывают антитела против антигена, использованнного для имму-

низации. Антиген прикрепляют к какому-либо носителю,например, к

пластиковым шарикам или пленке. Такой иммобилизованный антиген

обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гибридо-

мы, а затем наносят меченые антитела против мышиных или крыси-

ных гибридомных антител (их метят радиоактивными, флуоресцент-

ными или ферментными метками). Иными словами, проводят анализ

культуральной жидкости на присутствие антител к искомому анти-

гену. Если гибридомы производят антитела, то они осядут на ан-

тигене, а к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антитела.

В результате метка соединится с антигеном на носителе и зафик-

сируется.

5. Клонирование. Для этой цели несколько гибридных клеток

переносят на питательную среду таким образом, чтобы они росли

на достаточном расстоянии друг от друга. Через несколько дней

вокруг каждой образуется колония дочерних клеток. Это и есть

гибридома. Клетки колонии снова разводят и помещают на пита-

тельную среду, чтобы устроить новые колонии. Клонирование пов-

торяют 3-4 раза, после чего получается устойчивая и продуктив-

наялиния клеток.

6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональ-

ных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в

искусственных условиях или непосредственно из животных, приви-

тых гибридомными клетками (как и многие злокачественные опухо-

ли, гибридому можно прививать).

_Преимущества МАТ .:

1. Главная особенность МАТ - чрезвычайная моноспецифичность

(против одной антигенной детерминанты) и абсолютная однород-

ность.

2. Возможность многократного получения в течение длительного

времени (воспроизводимость).

3. Неограниченное количество получаемых антител.

3. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значе-

ний, предельных для живой природы. Отсюда возможность использо-

вания для анализа антигенов не высокой степени чистоты.

К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ.

МАТ предполагается использовать в лечебных целях в качестве

целенаправленных носителей, в состав которых будут включены

токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные пре-

параты. Такие конъюгаты можно использовать в химиотерапии опу-

холей и при трансплантации органов и тканей (введением МАТ про-

тив ОКТ 4,8,11; через 13 суток вырабатывались АТ на введенные

МАТ)./6815,6816/

_Недостатки МАТ .:

1. Одна из проблем, связана с тем, что МАТ - продукты мыши-

ных гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получе-

ния человеческих МАТ.

2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантой и отсутс-

твие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной мо-

лекуле антигена. 5Недостаток МАТ - отсутствие преципитационных

5свойств, в связи с чем чаще всего в тестах используются смеси

5моноклональных антител. 0

3. Возможность непредсказуемых пекрестных реакций с поли-

функциональными антигенными детерминантами.

4. Вследствие этого - низкий аффинитет МАТ.

_Исследование влияния на антителообразование

5Для изучении влияния фармакопрепаратов на первичный иммунный

5ответ животным вводят вещество (допустим, кордиалин в физиологи-

5ческой дозе 0,15 мг/кг в течении 3 недель 3 раза в неделю).

5Контрольная группа должна получать такое же количество физиоло-

5гического раствора. Допустим, на 14-е сутки, после первого вве-

5дения, животных иммунизируют эритроцитами барана в дозе 108 кле-

5ток на мышь (внутрибрюшинно). На 20-е сутки эксперимента в реак-

5циях гемагглютинации и гемолиза можно определить титр гемагглю-

5тининов и гемолизинов.

5В селезенке животных оценивают количество антителообразующих

5клеток (АОК) по методу A.Cunningham (1965), сравнивая их коли-

5чество в опыте и контроле. Коэффициент стимуляции антителообра-

5зования в обеих сериях рассчитывают по отношению количества

5АОК, приходящихся на 106 ядросодержащих клеток в опыте, к соот-

5ветствующему количеству АОК в контроле.

5Литература: Зимин ... Лабораторное дело. - 1984. - N 9. -

5С.556. 0

3ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

- Подсчет относительного и абсолютного _количества . Т-лимфоци-

тов. Персистирование высоких количеств CD8-клеток может

указывать на хроническую вирусную инфекцию. /1575к/90/ Ко-

личество СD4 5+ 0-клеток снижается при СПИДе.

- Определение медиаторов клеточного иммунного ответа /ИО/ в

крови и тканях (ИЛ-2).

- Развитие клеточного _иммунного ответа ..

- Определение функциональной _активности . иммунокомпетентных

клеток:

-- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип, по-

ликлональная активация митогенами, антигенами в смешан-

ной культуре лимфоцитов /СКЛ/, тесты Т-хелперной и

Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ,

цитотоксическая активность, кожные тесты ГЗТ на тубер-

кулин, стрептокиназу, кандидин и пр.),

-- пролиферация мононуклеарных клеток (реакция бласттранс-

формации на митогены: ФГА, Кон А, митоген лаконоса /на

Т- и В-лимфоциты/),

-- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА.

- Определение ферментов лимфоцитов.

- Определение морфологии лимфоцитов.

2ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

Иммунопатологические состояния проявляются

- повышенной реактивностью

- сниженной реактивностью (иммунодефицитами).

Возможно сочетание данных состояний (в старости), разная ре-

акция на разные АГ. Поэтому данные два противоположных состоя-

ния можно лечить одними и теми же иммуномодуляторами (имммунос-

тимуляторами).

4Иммунопатологические состояния проявляются развитием преиму-

4щественно 4 основных синдромов:

4- аллергического синдрома (ГНТ-1)

4- аутоиммунного синдрома (ГНТ-2)

4- инфекционного синдрома (ИД) │

4- лимфопролиферативного синдрома (недостаточность │ИД

4апоптоза-?) │

3ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОДЕФИЦИТОВ

5(+ см. ИД в лекции по иммунопатологии)

- Снижение функциональной активности лимфоцитов, моноцитов,

нейтрофилов

-- сниженный уровень антител.

- Снижение количества иммунокомпетентных клеток.

- Падение комплементарной активности.

- Сниженная реакция лимфоидных органов на инфекцию (незначи-

Реферат опубликован: 7/04/2005 (67550 прочтено)