Страница: 12/26
зана не превышает 1/3 площади ядра;
В - количество клеток, в которых названные отложения зани-
мают от 1/3 до всей величины ядра;
Г - количество клеток с диформазановыми отложениями по пло-
щади превосходит площадь ядра.
НСТ-тест может быть сделан без дополнительной стимуляции
(спонтанный НСТ-тест) или после стимуляции нейтрофилов in vitro
(индуцированный НСТ-тест). /7062/
При патологии чаще ПОЛ растет. Поэтому если лечение выбрано
правильно, то процент активированных нейтрофилов быстро падает,
опережая динамику лейкоцитарных сдвигов, СОЭ и др. /7062/
Сниженные показатели НСТ-теста --- неблагоприятный исход
(сепсиса)
Повышенные показатели НСТ-теста --- опасность развития гной-
ных осложнений после операции.
Нормальные показатели НСТ-теста --- успешная терапия. /1365к/
[Преципитат с НСТ может образовывать гепарин. /1575к/90/]
На стекла с прилипшими клетками капают 5 капель (0,14 мл)
1,03% раствора нитросинего тетразолия (17мг на 14 мл).
(Pack B.I. и соавт. // Lancet. - 1968. - V.2. - P.532):
0,2% раствор НСТ (0,1 мл на 0,1 мл взвеси лейкоцитов, выде-
ленных из гепаринизированной крови). Пробирку со смесью помеща-
ли в термостат (37 5о 0С) на 25 минут, затем выдерживали при ком-
натной температуре 15 минут, после чего готовили мазки, фикси-
ровали в метаноле и окрашивали гематоксилином. В мазках подсчи-
тывали % гранулоцитов, включающих красители.
2Лизосомально-катионный тест (ЛКТ)
Растворами исследуемых полипептидов по 50 мкл заполняли лун-
ки иммунологического планшета, в которые вносили по 20 мкл
цельной крови здоровых доноров, взятой со скарифицированной
ранки пальца руки при помощи пипетки, предварительно промытой
раствором гепарина 250 ед/мл. Полученную взвесь клеток крови
инкубировали 1 час при температуре 37С. После инкубации готови-
ли мазки, сушили на воздухе при комнатной температуре и окраши-
вали по методу В.Е.Пигаревского и соавт. (1981) в 0,1 % забуфе-
ренном спиртовом растворе зеленого прочного с рН 8,2 в течение
20 минут. Дополнительную окраску мазков проводили 0,25% водным
раствором азура А. Окрашенные препараты промывали дистиллиро-
ванной водой, высушивали на воздухе и микроскопировали с ис-
пользованием масляной иммерсии.
При исследовании просматривали 100 гранулоцитов. Внутрик-
леточное содержание катионных белков крови оценивали полуколи-
чественно по величине среднего цитохимического коэффициента
(СЦК), вычисляемого по формуле:
3а + 2б + 1,5в + 1г + 0,5д + 0а
СЦК = -----------------------------------------,
100
где: а-е - количество однотипных клеток с определенной степенью
окрашиваемости цитоплазмы зеленым прочным, а цифры
показывают степень выраженности окраски;
0 - отсутствие окраски;
0,5 - наличие в цитоплазме единичных окрашенных гранул;
1 - половина цитоплазмы заполнена светлоокрашенными гра-
нулами;
1,5 - цитоплазма равномерно заполнена гранулами, окрашен-
ными в светло-зеленый цвет;
2 - цитоплазма содержит 1/3 часть своей площади темно-
зеленых гранул;
3 - цитоплазма содержит 2/3 части своей площади темно-
зеленых гранул.
2Определение хемотаксической активности лейкоцитов
Недостаточный хемотаксис сдерживает мобилизацию фагоцитов,
способствуя опережающему размножению бактерий. Снижение мигра-
ционной активности нейтрофилов в 2 раза сопровождается затяжным
торпидным течением пневмонии более чем у 50% детей. /7062/
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА
_Изотонический вероналовый буфер (VBS) ..
1 л раствора содержит 5,095 г веронала и 41,5 г NaCl, рН до-
водится до 7,40 1 М раствором NaOH. Перед работой буфер разбав-
ляют в 5 раз.
_Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Са 52+ 0 и Mg 52+
_(VBS 52+ 0) ..
2 л раствора содержит 5,75 г веронала, 3,0 г мединала, 85,0
г NaCl, 5 мл 1 М MgCl 42 0 и 1,5 мл 1 М СаСl 42 0, рН доводится до
7,40. Перед работой буфер разбавляют в 5 раз.
_Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Mg 52+ 0 и ЭГТА
_(VBS, . _Mg 52+ 0-ЭГТА) ..
К 850 мл изотонического вероналового буфера (VBS), разбав-
ленного в 5 раз, добавляется 100 мл 0,1 М раствора ЭГТА, рН 7,4
и 50 мл 0,1 М раствора MgCl 42 0, рН доводится до 7,40.
_Изотонический фосфатный буфер (РВS)
0,85% раствор NaCl, содержащий 2% по объему 0,2 М нат-
рий-фосфатного буфера, рН 7,20.
_Изотонический трис-буфер с ЭДТА (TBSE) ..
Содержит 5 мМ трис, 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТА 5. 0Na 42 0, рН 7,2 (до-
водится 0,01 М NaOH).
_Раствор Олсвера ..
В 750 мл дистиллированной воды растворяли 8,0 г цитрата нат-
рия (дигидрата натриевой соли), 4,2 г NaCl и 20,0 г глюкозы,
добавляли 4 ~ 05,5 мл 10% лимонной кислоты до рН 6,1 и доводили
объем раствора до 1 л. Для взятия крови раствор Олсвера стери-
лизовали.
Другие буферные растворы готовили по общеизвестным методи-
кам.
_Приготовление стандартных взвесей эритроцитов
Эритроциты барана. Кровь барана из яремной вены отбирали с
соблюдением асептических условий в равный объем стерильного
раствора Олсвера со стеклянными шариками, перемешивали и сте-
рильно разливали по пробиркам. Оставляли на 3-7 суток при 4 5о 0С
для стабилизации клеток. Стерильно отобранные эритроциты можно
хранить около 2 месяцев при 4 5о 0С.
_Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов ..
Осадок эритроцитов трижды промывали 10-20-кратным объемом VBS 52+
с последующим центрифугированием (1000 g) в течение 5-10 мин.
Отмытые эритроциты суспендировали в VBS 52+ 0 таким образом, чтобы
после 15-кратного разбавления водой суспензия обладала поглоще-
нием при 541 нм равным 0,7, что соответствует концентрации кле-
ток в суспензии 1 5. 010 59 0 клеток/мл. Для стандартизации пользова-
лись формулой V 4k 0 = V 4o 5. 0A 4541 0/0,7, где V 4k 0 - конечный объем суспен-
зии, V 4o 0 - начальный объем с концентрацией, определяемой по ве-
личине А 4541 0. Стандартизированные эритроциты хранили при 4 5о 0С и
использовали в работе в течение нескольких суток.
_Приготовление сенсибилизированных эритроцитов (ЕА) ..
К взвеси эритроцитов (стандартизированных до 1х10 59 0 кле-
ток/мл) прибавляли равный объем гемолитической сыворотки, раз-
бавленной VBS 52+ 0 в отношении 1:400, тщательно перемешивали и ин-
кубировали 30 мин при 37 5о 0С, периодически перемешивая. После за-
вершения инкубации взвесь эритроцитов доводили до концентрации
1,5 5. 010 58 0 клеток/мл, добавляя VBS 52+ 0 таким образом, чтобы 0,2 мл
суспензии ЕА в смеси с 2,8 мл Н 42 0О давали 1,0 ед. оптической
плотности при 412 нм. Стандартизированную взвесь ЕА хранили при
4 5о 0С и использовали в работе в течение одного дня.
Эритроциты кролика получали, отбирая кровь из ушной вены жи-
вотного в стерильный раствор Олсвера, который постоянно переме-
шивали со стеклянными бусами. Эритроциты хранили в этом раство-
ре при 4 5о 0 до 1,5-2 месяцев. Для стандартизации эритроциты отмы-
вали трижды раствором VBS с последующим центрифугированием при
1000-1500g в течение 5 мин, дважды - раствором VBS, Mg 52+ 0-ЭГТА и
в последнем буфере приготовляли стандартную суспензию таким об-
разом, чтобы при 15-кратном разбавлении дистиллированной водой
(0,2 мл суспензии и 2,8 мл Н 42 0О) она имела поглощение 1,0 при
412 нм. Стандартную взвесь эритроцитов кролика использовали в
работе в течение одного дня.
Эритроциты барана и кролика более стабильны (менее подверже-
ны спонтанному лизису), если буферы, используемые для стандар-
тизации, содержат 0,1% человеческого сывороточного альбумина.
_Инактивация комплемента ..
Для проведения серологических реакций систему комплемнта
часто инактивируют при 56 5о 0 30 минут. При этом теряют активность
С2,С4,фактор В, в результате чего прерывается активация как
КПК, так и АПК.
2Определение общей гемолитической активности
2системы комплемента 0
Предложено несколько методов определения уровня комплемента.
_Классический путь активации системы комплемента . (КПК) опре-
деляли по методу P.G.Adrian (1983) и S.Tanaka et al. (1986).
Для постановки реакции использовали суспензию эритроцитов бара-
на в концентрации 109 клеток/мл, предварительно сенсибилизиро-
ванных антисывороткой к ним. К 280 мкл веронал-мединалового бу-
фера (рН 7,4), содержащего 5 мМ MgCl2 и 0,75 мМ CaCl2, добавля-
ли 20 мкл рабочей концентрации сыворотки здоровых доноров, раз-
бавленной в том же буфере. Рабочая концентрация сыворотки под-
биралась таким образом, чтобы лизировалось 50-60 % эритроцитов
за 20 минут. В систему вносили 20 мкл раствора исследуемого по-
липептида (контроль- 20 мкл веронал-мединалового буфера). Пробы
инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, пос-
ле чего вносили 200 мкл суспензии эритроцитов барана, сенсиби-
лизированных антителами. Смесь встряхивали и инкубировали 20
минут при температуре 37С в водяной бане. По истечении времени
Реферат опубликован: 7/04/2005 (67804 прочтено)