Биотехнология, биопрепараты

Страница: 13/26

реакцию гемолиза останавливали погружением пробирок в ледяную

баню и разведением системы охлажденным забуференным физиологи-

ческим раствором (2,5 мл буфера). Эритроциты осаждали при 3000

об/мин в течение 5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли

спектрофотометрически по оптической плотности супернатанта при

длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыворотку.

Для определения _альтернативного пути активации . системы комп-

лемента /АПК/ (Козлов Л.В., Соляков Л.С., 1982; Tanaka S. et

al., 1986) к 280 мкл веронал-мединалового буфера (рН 7,4), со-

держащего 5 мМ MgCl2 и 10 мМ этиленгликоль-тетрауксусной кисло-

ты добавляли рабочую дозу сыворотки здоровых доноров (20 мкл) и

20 мкл исследуемого полипептида. Смесь инкубировали при комнат-

ной температуре 20 минут, а затем добавляли 200 мкл суспензии

эритроцитов кролика в буфере (1,5х10 58 _ 0 .клеток/мл). Смесь встря-

хивали и помещали в водяную баню при температуре 37С на 20 ми-

нут. Реакцию гемолиза останавливали добавлением 2,5 мл охлаж-

денного до 4С забуференного физиологического раствора, а затем

содержимое пробирок центрифугировали при 3000 об/мин в течение

5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли на спектрофото-

метре при длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыво-

ротку.

Гемолитический метод титрования комплемента

2по 50% или 0 2100%-му гемолизу

Титром комплемента является наменьшее количество исследуемой

активности сыворотки, способствующее полному гемолизу добавлен-

ного количества (0,5-1 мл) сенсибилизированных эритроцитов.

Для титрования комплемента по 100%-му гемолизу активную исс-

ледуемую сыворотку, разведенную в 10 раз, разливают в 11 проби-

рок в количестве 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ... 1; 1,1 мл. Сыворотку

доводили физиологическим раствором до 1,5 мл, после чего в каж-

дую пробирку добавляют 1 мл гемолитической системы (1,5% взвесь

эритроцитов барана, обработанных антителами в конечном титре

1:3). Учет результатов производили после 45-минутного инкубиро-

вания взвеси в термостате при 37 50 0С.

Для расчета берут пробирку, в которой получен полный гемо-

лиз. Например, полный гемолиз произошел в пробирке N 4 с дозой

активной сыворотки 0,4мл; следовательно, титр комплемента равен

0,04.

СН 450 0 - минимальное количество сыворотки, которое вызывает

лизис 50% сенсибилизированных бараньих эритроцитов, находящихся

в 0,5мл стандартной суспензии при 37 50 0С в течение 30 минут.

1Количественное определение уровня комплемента

1в весовых 3 1единицах

Среди больных с бактериальными инфекциями (пневмония, сеп-

сис) опсонический резерв альтернативного пути активации компле-

мента нередко в 5-10 раз ниже нормы. /7062/ Классический путь

более устойчив к нарушениям внутренней среды и менее пригоден

для их регистрации. /7062/ При падении активности АПК до 30% от

среднего уровня взрослых септические проявления пиогенного про-

цесса отмечали у 80% больных. /7062/

2Приготовление реагентов 0 для определения

активности отдельных компонентов комплемента

_Сыворотка человека. . Донорскую кровь отбирали в сухую сте-

рильную посуду и оставляли на 2 суток при 4 5о 0С. После этого сы-

воротку крови сливали декантацией и центрифугировали в течение

20 мин при 3000g. Супернатант разливали по пробиркам и хранили

при -70 5о 0С.

_Приготовление реагента R2 для определения гемолитической ак-

_тивности компонента С2 .. Сыворотку разливали в тонкостенные про-

бирки по 3 мл и инкубировали в водяном термостате при 50 5о 0С

(внутри пробирок). Отбирали пробы через каждые 10 мин, опреде-

ляя активность компонентов С1, С1q, С4 и контроль на гемолиз по

методике определения С2, используя в качестве R2 отобранную

пробу. В качестве R2 выбирали сыворотку, инкубированную в тече-

ние такого времени, при котором сохраняется активность компо-

нентов С1 и С4 при достаточно низком контроле. R2 хранили при

-70 5о 0С в течение года.

_Приготовление реагента R4 для определения гемолитической ак-

_тивности компонента С4 .. К 1 мл комплемента морской свинки до-

бавляли 0,25 мл 0,075 М раствора гидразингидрата, смесь инкуби-

ровали 1,5 ч при 20 5о 0 и нейтрализовали добавлением 0,25 мл 0,15

М HCl, после чего диализовали против РВS в течение 18 ч при

4 5о 0С. Реагент хранили при -70 5о 0С и использовали в качестве R4

после предварительного разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.

_Приготовление реагента R3 для определения гемолитической ак-

_тивности компонента С3 .. К 10 мл охлажденной до 4 5о 0С свежей сыво-

ротки при непрерывном перемешивании медленно приливали 10 мл

охлажденного насыщенного при 4 5о 0С раствора КВr. Смесь инкубиро-

вали 18 ч при 4 5о 0С, затем диализовали в течение 18 ч против PBS.

Реагент хранили при -70 5о 0С. В качестве R3 использовали реагент,

разбавленный VBS 52+ 0 в соотношении 2:3.

_Приготовление реагента R3 . 5oxy _ 0 для определения гемолитической

_активности компонента ..

Реагент R3 5oxy 0 готовили окислением компонента С2 в реагенте

R3. Реагент R3 готовили как описано выше. Окисляющий раствор

готовили растворением 8,3 г KI и 0,25 г I 42 0 в 4 мл фосфатного

буфера, рН 6, ионная сила 0,1 (105 мл 1 М NaH 42 0PO 44 0 + 35 мл 0,5 M

Na 42 0HPO 44 0 + H 42 0O до 1,5 л), затем доводили объём до 10 мл тем же

буфером. Хранили в темной склянке при 4 5о 0 в течение недели.

Окисляющий раствор (10 мкл) добавляли к 2 мл реагента R3 инку-

бировали 5 мин при 4 5о 0 и нейтрализовали избыток иода добавлением

1 мг глюкозы на 1 мл пробы. Реагент R3 5oxy 0 хранили при -70 5о 0 и

использовали в качестве реагента R3 5oxy 0 после предварительного

разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.

_Приготовление реагента R1q с помощью IgG-стекла ..

К 10 мл сыворотки крови человека добавляли 37,2 мг ЭДТА 5. 0Na 42 0,

осторожно перемешивали на магнитной мешалке до растворения соли

(конечная концентрация 10 мМ) и доводили 0,15 М NаОН до рН 7,2.

Подготовленную таким образом сыворотку наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5х2 см), уравновешенную TBSE, со скоростью 15

мл/ч. Колонку промывали 50 мл TBSE со скоростью 35 мл/ч. Фрак-

ции несвязавшегося на колонке белка (50 мл) не проявляли актив-

ности С1q. Фракции несвязавшегося белка с максимальным поглоще-

нием при 280 нм объединяли (18 мл), добавляли раствор, содержа-

щий 0,3 М CaCl 42 0, 1 M MgCl 42 0, pH 7,4, из расчета 15 мкл раствора

на 1 мл фракции, доводили до рН 7,4, диализовали в течение ночи

против VBS 52+ 0, разливали небольшими аликвотами по пробиркам, за-

мораживали и хранили при -70 5о 0С. Использовали в качестве реаген-

та R1q, после размораживания непосредственно перед титрованием

С1q.

_Получение реагента R1 с помощью IgG-стекла.

5 мл охлажденной сыворотки при 4 5о 0 наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5 х 2 см), уравновешенную VBS pH 7,4, содержащим

0,001 М СаСl 42 0, со скоростью 8 мл/ч. Фракции несвязавшегося бел-

ка собирали по 2 мл и определяли остаточную активность С1q и

С1r 42 0s 42 0, фракции с максимальным поглощением при 280 нм объединя-

ли (10мл), диализовали против VBS 52+ 0 в течение ночи, разливали

небольшими аликвотами по пробиркам, замораживали и хранили при

-70 5о 0. Колонку IgG-стекло-С1 использовали в дальнейшем для выде-

ления С1q, C1r и C1s.

1Гемолитические методы определения активности

1компонентов и факторов комплемента

_Определение гемолитической активности компонентов С2 и С4 .. К

0,2 мл стандартизованной суспензии ЕА в VBS 52+ 0 добавляли 0,05 мл

реагента (R4 или R2 в соответствующем разведении) и 0,25 мл

тестируемой пробы. Смесь инкубировали 30 мин при 37 5о 0, добавляли

2,5 мл 0,15 М NaCl и центрифугировали при 1500g в течение 5

мин. Степень гемолиза определяли по А 4412 0, измеренному против

буфера. Кроме того, ставили контроли на спонтанный лизис (0,2

мл ЕА и 0,3 мл буфера), а также контроль на полный лизис эрит-

роцитов (0,2 мл ЕА и 2,8 мл Н 42 0О). Измеренную величину гемолиза

выражали в виде Z (количество эффективных молекул), которую оп-

ределяли по формуле:

Z = ln _К 4П.Л. 5_ 0 К 4R

К 4П.Л. 0- А 4412 0 ,

где К 4R 0 - контроль реагента (буфер вместо тестируемой пробы),

К 4П.Л. 0 - контроль на полный лизис эритроцитов, А 4412 0 - измеренное

значение тестируемой пробы.

_Определение гемолитической активности компонентов С3 .. К 0,2

мл ЕАС14 (приготовление комплекса описано ниже) добавляли 0,05

мл реагента (R3 или R5 в соответствующем разведении), 0,25 мл

тестируемой пробы и смесь инкубировали при 37 5о 0 в течение 30

мин. После инкубации добавляли по 2,5 мл 0,15 М NaCl и центри-

фугировали при 5 мин при 1500g. Степень гемолиза определяли по

поглощению при 412 нм, измеренному против буфера. В качестве

контролей ставили контроль реагента (0,25 мл буфера вместо тес-

тируемой пробы), контроль на спонтанный лизис эритроцитов (0,2

мл ЕАС1 4 и 0,3 буфера) и контроль на полный лизис эритроцитов

(0,2 мл ЕАС1 4 и 2,8 мл Н 42 0О). Измеренные значения гемолиза вы-

Реферат опубликован: 7/04/2005 (67542 прочтено)