Серологические реакции

Страница: 7/8

5комплемента. Параллельно ставится два контроля - контроль гемо-

5литической сыворотки (с физраствором) и контроль комплемента.

5Определив титр комплемента, высчитываем рабочую дозу, кото-

5рая представляет собой титр комплемента, увеличенный на 20-30%,

5так как комплемент в опыте подавляется антигеном.

56. Определение рабочей дозы антигена:

5Раститровывают антиген в конечном объеме 1мл, затем добавляют

5комплемент, штатив встряхивают и оставляют на 1 час при 370С. К

5смеси приливают по 1мл гемолитической системы и инкубируют 1

5час.

5Титром считается наименьшая доза, при которой прекращается

5задержка гемолиза, т.е. отсутствует его комплементарное дейс-

5твие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составля-

5ющую примерно 1/2 - 2/3 ее титра во избежание комплементарного

5действия при постановке реакции.

57. Постановка реакции РСК.

5- Раститровывают сыворотку больного, предварительно прогре-

5тую при 520С в течение 20 минут для инактивации собственной

5системы комплемента.

5- Добавляют рабочую дозу антигена,

5- комплемента и инкубируют 10-30 минут при 370С.

5- Затем вносится гемолитическая система и штатив инкубирует-

5ся еще 30 минут при 370С.

5Задержка гемолиза свидетельствует о наличии антител к ис-

5пользуемому антигену в сыворотке больного.

5Учет РСК с парными сыворотками. (титром специфических в дан-

5ному антигену антител считается титр последнего разведения сы-

5воротки, полностью тормозящего гемолитическую реакцию.)

5Титром гемолизина считается наибольшее разведение гемолизи-

5на, с которым получается полный гемолиз 0,5мл взвеси бараньей

5крови в присутствии комплемента.

Реакция Вассермана (РСК) используется для диагностики сифи-

лиса. Антигеном служит экстракт пораженного органа или другой

аналогичный материал.

II. _ 2ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

2ЦЕПНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

5- Не серологическая (без использования АГ и АТ), но также

5гибридизации фрагментов ДНК и РНК. 0 5высокоспецифическая диагнос-

5тическая реакция.

ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод, теоретически для по-

лучения результата достаточно иметь в среде одну молекулу ДНК.

/2400к/

5ПЦР была разработана Мюллесом в 1983г. на основе технологии

Методы ДНК-гибридизации и ЦПР используются для геносистема-

тики и идентификации патогенных микроорганизмов. /2287к/96/

1Основа метода 0 - катализируемое ДНК-полимеразой многократное

образование копий (амплификация) определенного участка ДНК.

1Этапы метода:

│- термическое разделение 2-нитевой молекулы ДНК на отдель-

│ ные цепочки (30-40с. при 93-95 5о 0С),

│- охлаждение среды и

│- внесение праймеров, комплементарных нуклеотидным после-

│ довательностям обеих цепочек.

Для запуска реакции используют синтетические _ 1праймеры . 0 - оли-

гонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующие

с окончаниями последовательностей и образующие последователь-

ности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную

полимеразу (tag-полимеразу /от вида бактерии Thermus aquati-

cus/), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК,

после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогрева-

ют. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и

снова повторяют процедуру прогрева и охлаждения. /2400к/

После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их иденти-

фикацию методом электрофореза. /2400к/

5Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы

5можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или

5провести реакцию ДНК-гибридизации. /2400к/

5ПЦР позволяют анализировать геномную ДНК или РНК-транскрип-

5ты, выделенные из единственной клетки. И хотя эти методы не

5требуют большого количества клеток, их ограничения связаны с

5доступностью специфических праймеров и их, как правило, приме-

5няли для выявления уже известных или родственных им генов.

5Такое ограничение было преодолено после разработки методов,

5позволивших амплифицировать весь спектр мРНК. В них использова-

5лась природная особенность всех мРНК нести поли(А+)-последова-

5тельность на 3'-конце. Комплементарная ДНК (кДНК), полученная с

5мРНК в реакции обратной транскрипции, приобретала таким образом

5сайт связывания одного из праймеров для амплификации в ЦПР.

5Другой сайт был образован путем добавления гомополимерного

5хвоста с помощью терминальной трансферазы. Однако все эти мето-

5ды использовали стадию экстракции ДНК, что затрудняло их приме-

5нение в отношении небольшого количества клеток. /2286к/96/ 0

┌──── 76 0 ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ термическая денатурация ДНК (95 5о 0)

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ Отжиг праймеров

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴

│ ┬┬┬┬┬┬ - праймер

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ Синтез комплементарных нитей ДНК при охлаждении

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ 2┴┴┴┴┴┴ 0┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ ┴ ┴ ┬ ┬

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬ 2┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ │

│ │ Завершение первого цикла

│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

│ +

└───── ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬

и т.д. ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴

5Этот недостаток был преодолен в работе Brady, в которой все

5стадии синтеза кДНК были проведены в одной первичной клеточной

5суспензии без единой экстракции. /2286к/96/

5В последнее время стали пользоваться большой популярностью

5магнитные бусы фирмы "Dynal". Последовательности олиго(дТ)25,

5ковалентно сшитые с бусами, позволяют легко выделять мРНК из

Реферат опубликован: 15/06/2005 (23459 прочтено)