Серологические реакции

Страница: 5/8

ELISA-МЕТОД=РЭМА

(Enzyme-linked immunosorbent assay =

реакция энзим-меченных атомов)

5Метод независимо разработали в начале 70-х годов шведские

5исследователи Энгвалл и Перлманн, голландские ван Веемен и Шуур

5и американские исследователи под руководством Рубинстайна.

К настоящему времени созданы многочисленные модификации ба-

зовой методики и наибольшее распространение получил гетероген-

ный ИФА на твердой фазе ( _твердофазный ИФА .). Коммерческие МАТ

(или АГ) фиксируют на лукнах пластиковых панелей, реже иммоби-

лизуют на бусах или нитроцеллюлозных мембранах. /2400к/

Лунка иммунологической планшеты с "пришитыми" антигенами

(диагностические планшеты)

│ │

│ │ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)

│АГ>── 4Y 0 │ 4 Y

│ │* │ │ - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,

│ │ меченая пероксидазой хрена)

└────────────────┘ * - пероксидаза (ПХ) хрена

Н 42 0О 42 ───── 0Н 42 0О + [O]

5ПХ 0 радикал кислорода

+ раствор Н 42 0О 42 0 и красителя (хромогена),

изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода (орто-фе-

нилендиамин) --- спектрофотометрия (под вертикальным лучом)

После каждого этапа обработки планшета промывается физраст-

вором или буфером.

5ИФМ можно определить белки, содержащиеся в количестве нес-

5кольких нанограммов в 1 мл. В качестве ферментных меток исполь-

5зуют пероксидазу хрена, глюкозоксидазу, бета-галактозидазу или

5щелочную фосфатазу. 0

5Этапы:

5Первым этапом является связывание моноспецифических антител

5(или антигена, если искомым белком является антитело) на твер-

5дом субстрате, обычно на стенках пластиковой пробирки или план-

5шеты. Связывание происходит путем физической адсорбции белка на

5гидрофобной поверхности. 0

5- Полистироловая (полистереновых) планшетка обрабатывается

5антигеном для их сорбции (или антителами).

5- Добавляется альбумин (забиваются все свободные сайты свя-

5зывания, чтобы не было затем неспецифической сорбции антител). 0

5- Обработка антителами или сывороткой больного, содержащей

5предполагаемую разновидность антител.

5- Добавляется антисыворотка, меченная ПХ (пероксидазой хре-

5на).

5- Приливается реактив АВТS или др., который окрашивается

5после воздействия пероксидазы. Можно использовать смесь переки-

5си водорода и хромогена (ортофенилдиамина, изменяющего окраску

5в зависимости от количества радикальных форм кислорода от свет-

5ло-желтой до коричневой).

5- О наличии и количестве АТ судят по изменению цвета и ин-

5тенсивности окраски раствора. Измерение интенсивности окраски

5на спектрофотометре /СФ/. 0

5[ИФМ можно проводить двумя путями - по непрямому (описанному

5выше) и конкурентному типу. В первом случае конкурентные отно-

5шения отсутствуют: исследуемая биологическая жидкость реагирует

5с твердофазными антителами, после чего на удаляется из и в ре-

5акцию вводят меченые ферментом антитела, которые связываются

5уже иммобилизованным антигеном. В этом случае ферментативная

5активность прямо пропорциональна количеству антигена в исследу-

5емом материале. Во втором случае антиген, меченный ферментом,

5конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за выделенные на

5твердой фазе антитела, и ферментативная активность обратно про-

5порциональна количеству антигена в исследуемом образце.]

5В качестве твердой фазы используют вещества различного хими-

5ческого состава - полистирен, полипропилен, поливинил, гели

5декстрана, агарозы, полиакриламида, целлюлозы, нитроцеллюлозы,

5нейлон.

3РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД /АНАЛИЗ/ (РИМ=РИА)

РИСТ - радиоиммуносорбентный метод

Ставится аналогично ИФА, но с использованием антител, мече-

ных радиоактивным изотопом.

│ │

│ │ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)

│АГ>── 4Y 0 │ 4 Y

│ │* │ │ - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,

│ │ меченая изотопом)

└────────────────┘ * - радиоактивная метка --- счетчик

радиоактивности

Работа проводится в радиоизотопных лабораториях.

Используются антитела, меченные радиоактивным элементом -

иодом ( 5125 0I, 5131 0I) или др. - с последующим измерением радиоак-

тивности. Если предыдущие иммунохимические методы способны

улавливать концентрацию белка не ниже 1 мкг/мл, то с помощью

РИМ можно определить концентрации, измеряемые в пикограммах,

поэтому метод РИА считается одним из подходящих количественных

методов иммунохимического анализа.

Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию ради-

оактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специаль-

ных счетчиков бета- или гамма-излучения. Метод высокочувствите-

лен, но постепенно вытесняется иммунофлюоресцентным анализом.

/2551к/

3ИММУНОБЛОТТИНГ

и дот-микросвязывание

1Постановка методики:

│- Вертикальный электрофорез пробы в течение ночи

│- Снятие отпечатка на нитроцеллюлозную бумагу (полоски

│ или цельную)

│- Инкубация полосок бумаги в растворе антисыворотки к иско-

│ мому антигену. Промывка от несвязавшихся АТ.

│- Инкубация в растворе противовидовой антисыворотки (раст-

│ воре АТ второго порядка), меченых ПХ (пероксидазой хрена)

│- + раствор Н 42 0О 42 0 и красителя, изменяющего цвет в присутс-

твии радикалов кислорода. Присутствие АГ расценивается по

наличию окрашенных красителем пятен на бумаге.

5Метод основан на разделении полипептидов в ПААГ (полиакрила-

5мидном геле) и анализе разделения иммунохимическими методами

5после переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану,

5на которой белки доступны для любого вида твердофазного иммуно-

5анализа (иммуноферментного или радиоиммунного).

5Этапы:

51. Электрофорез исследуемой смеси пептидов и маркеров с из-

5вестной молекулярной массой в ПААГ.

52. Окраска геля нитратом серебра.

53. Перенос следов белка на нитроцеллюлозную бумагу или мемб-

5рану на основе нейлона (отпечаток геля) с получением реплики

5электрофореграммы. Процесс переноса называется блоттингом, а

5полученный отпечаток - блотом или блотограммой. 0

54. Обработка бумаги в полиэтиленовом пакете в антисыворотке

5к исследуемым антигенам. Промывка.

55. Обработка антителами к фракции иммуноглобулинов, связан-

5ных с пероксидазой или с биотином (ИФМ).

56. Окраска авидин-пероксидазой или диаминбензидином с добав-

5лением перекиси водорода. Промывка. Высушивание. 0

.

3РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ /РН/

_ 21) РН вирусов в цветной пробе (в культуре ткани).

Допустим, у больного грипп типа В:

│ │ │ │ │ │

│ │ │РН │ │ │

├───┤ ├───┤ ├───┤

│ В │ │ В │ │ В │

└───┘ └───┘ └───┘

+ АТ к А + АТ к В + АТ к С

(+ антисыворотка - " - (+ антисыворотка

к вирусу типа А) │ к вирусу типа С)

Во второй пробирке

произойдет нейтра-

лизация вируса (РН).

Добавленные клетки

останутся живыми.

1Постановка методики:

│Вирусная культура

│+ антисыворотка к белкам адгезии вирусов (НА)

│ --- инактивация вируса (неспособность проникать в клетки

│ для репродукции)

│+ культура клеток --- гибели нет (метаболизм клеток продол-

│ жается, среда закисляется и окраска среды 199 меняется на

│ желтую.

При выявлении одного, допустим, из 3 типов вирусов гриппа

(А,В,С) в 3 пробирки добавляют исследуемую культуру вируса (ал-

лантоисную жидкость куриного эмбриона), затем в каждую пробирку

свою антисыворотку (против А, против В, против С) и после пре-

динкубации - культуру клеток в среде 199. В двух из трех проби-

рок АТ не свяжут вирусы, вирусы проникнут в клетки; клетки по-

гибнут, метаболизм прекратиться (среда перестанет желтеть и ос-

танется исходной - малиновой).

_ 22) РН вирусов в культуре ткани . 0 или курином эмбрионе по нейт-

рализации ЦПД.

Ставится аналогично, но наблюдается не изменение цвета пита-

тельной среды, а (чаще под микроскопом) отсутствие ЦПД (цитопа-

тогенного действия вируса) - образование многоклеточного синци-

тия, гигантских многоядерных клеток, появление включений, вези-

куляция клеток и пр.

_ 23) РН токсина антитоксической сывороткой

а) in vitro

- Реакция флоккуляции (хлопьеобразования)

Реферат опубликован: 15/06/2005 (23208 прочтено)