Серологические реакции

Страница: 3/8

1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть, АТ нет

- "пуговка" (РА нет, АТ есть

Последняя ячейка с положительной пробой ("пуговкой") означа-

ет титр АТ.

б) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у

больного по выделенной культуре

1Постановка реакции:

3 ряда лунок в иммунологической планшете:

│Антисыворотка к вирусу гриппа типа А --- раститровка

│Антисыворотка к вирусу гриппа типа В --- раститровка

│Антисыворотка к вирусу гриппа типа С --- раститровка

│+ Вирус-содержащий материал от больного (культура, но-

│ совая жидкость) во все 3 ряда

│ (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,

│ если нужно сориентироваться в количестве вирусов)

│+ эритроциты любого вида животного

1Результат: 0 - ряд с "пуговками" означает тип вируса.

5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) - 0,25мл;

5- добавляется вирус в четырехкратном титре (разведение в 4

5раза от исходного титра)

5- инкубируют 30 минут при 37оС

5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов

5- инкубируют 30 минут при 37оС или 45 минут при комнатной

5температуре.

в) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у

больного по наличию антител в сыворотке крови

1Постановка реакции:

3 ряда лунок в иммунологической планшете:

│Сыворотка больного --- раститровка в 3 рядах

│+ Музейный вирус типа А (в первый ряд)

│+ Музейный вирус типа В (во второй ряд)

│+ Музейный вирус типа С (в третий ряд)

│+ эритроциты любого вида животного

1Результат: 0 - ряд с наибольшим количеством "пуговок" означает

наибольший титр АТ у больного к данному типу

вируса, что предположительно говорит о соот-

ветствующем гриппе (для доказательства оценива-

ют титр АТ в динамике с интервалом в 2 недели;

при увеличении титра минимум в 4 раза можно го-

ворить об острой инфекции и соответствующем за-

болевании).

3РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ

Реакции иммобилизации основаны на способности специфических

АТ, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять подвижность

различных микроорганизмов.

На практике нашли применение реакции иммобилизации бледной

трепонемы и холерного вибриона.

3РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)

- реакции взаимодействия между антигеном и антисывороткой с

образованием видимого "осадка" (преципитата) - преципитирующих

иммунных комплексов (ПИК). 5МАТ (моноклональные АТ) одновалент-

5ные, поэтому в РП пока не используются. 0

┌───────────────── РП ────────────────────┐

_В жидкой фазе . _В агарозе . (1%)

- реакции кольце- - в т.ч. электрофоретические

преципитации (в этом случае агароза варится

- нефелометрия на веронал-мединаловом буфере

(ВМБ, рН 8,6)

Механизм взаимодействия антигенов и антител:

АГ │ АГ=АТ │ АТ

(пропорциональное

количество АГ и АТ;1:1)

│ │ │ │ │ │ │

│ │

┌───┐ о о │ / \ / \ / \ / \ / \│ Y Y ┌───┐

│АГ │ о о │ о о о о о │ Y Y │АТ │

└───┘ 7 0 о │ \ / \ / \ / \ / \ /│ Y └───┘

о о │ │ │ │ │ │ │ Y

ПИК

(преципитирующие ИК,

преципитат)

1) _ 2Реакция кольцепреципитации

│─│

│ │- АГ

│ │

│=│- зона преципитации (помутнения) в пробирке или капилляре

│ │

│ │ - Антисыворотка

└─┘

а) _Определение С-реактивного белка . (СРБ): капилляр наполови-

ну заполняют антисывороткой к СРБ и дополняют сывороткой боль-

ного. Капилляр вставляют в пластелиновую пробку и оставляют до

утра. Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии

СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности

деструктивных процессов в организме).

5Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-

5не 0ц 5 треть - исследуемой сывороткой. Капилляр покачивают 12-15

5раз для смешивания ингредиентов и устанавливают вертикально на

5пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной темпера-

5туре. Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии

5СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности

5деструктивных процессов в организме).

5Результат оценивают по высоте преципитата в капилляре.

б) _Диагностика сибирской язвы

Прокипяченый инфицированный материал

+ антисыворотка (медленно наносить; по стенке пробирки сте-

кает под слой АГ)

Инкубация несколько минут. Зона помутнения свидетельствует о

присутствии АГ в материале.

2) _ 2Нефелометрические, тербидиметрические методы

Принцип нефелометрии заключается в измерении количества све-

та, рассеиваемого частицами (ПИК) в жидкой среде. Для нефело-

метри оптимальны растворы низкой концентрации (в отличие от

турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концент-

рации, поскольку в этом случае измеряется потеря проходящего

света).

5Чувствительность метода - 100 мкг/мл антител или антигена

5при исследовании цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании

5чистых растворов. Данным методом можно проводить до 120 анали-

5зов в час. Время образования ИК можно значительно сократить,

5если ее проводить в 4% полиэтиленгликоле с М. 6000Д.

3) _ 2Метод преципитации в геле по Оухтерлоню

Стекла или чашки Петри заливают 1-2% агаром или агарозой.

После застывания агара вырезают по трафарету лунки. В одни лун-

ки вносят исследуемые сыворотки (препараты), в другие, располо-

женные напротив - соответствующие антисыворотки. Пластины инку-

бируют во влажной камере в течение 24-48 часов.

Варианты постановки:

- 2 лунки (диаметром 3-5 мм) на расстоянии 3-5 мм друг от

друга (одна с АТ, другая с АГ);

- в центре лунка с антисывороткой, вокруг лунки с разными

пробами АГ-содержащего материала (или наоборот, в центре - АГ,

по периферии - АТ);

- бороздка (или полоска пропитанной фильтровальной бумагой,

наложенной на агарозу) с антисывороткой (АТ-ми), по бокам лунки

с АГ или бляшки микробов, синтезирующих токсин (определение

токсигенности дифтерийной палочки).

4) _ 2Метод преципитации в геле по Манчини

_ 2(метод радиальной иммунодиффузии - РИД)

/ \---- зона преципитации

│ о--│---- лунка с точно дозированным количеством

\ 4--- 0/ сыворотки

Метод количественного определения антигенов основан на изме-

рении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении

исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в кото-

ром предварительно диспергирована моноспецифическая антисыво-

ротка. В слое агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм

на расстоянии 15мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят

с помощью микрошприца по 2мкл антигена (или стандартной сыво-

ротки) в разведениях 1/1, 1/2, 1/4, 1/8. Лунки следующих рядов

заполняются испытуемыми препаратами. Пластины инкубируют во

влажной камере в течение 24 часов (пластины с анти-Ig M сыво-

роткой - 48 часов). По окончании инкубации измеряют диаметры

колец преципитации. Концентрацию антигена определяют по калиб-

ровочной кривой.

Например, определение концентрации Ig M,G,A в сыворотке кро-

ви больных.

5) _ 2Ракетный электрофорез 0 2(электроиммунодиффузия)

1/4 о=== о - лунки с точно дизированным

1/2 о====== количеством сыворотки

1/1 о========== === - зоны преципитации

2- + 0 (измеряется длина зон, мм)

Катод Анод

1/1, 1/2, 1/4 - разведения стандартной сыворотки (т.е.

сыворотки с известным количеством антител)

Ставятся для построения калибровочной кривой.

В 1966г. Laurell разработал метод, сочетающий иммунодиффузию

с электрофорезом. Антиген движется в геле агарозы, содержащем

антисыворотку. Для электрофоретических реакций преципитации

агарозу расплавляют в веронал-мединаловом буфере (рН 8,6) в во-

дяной бане, остужают до 52 5о 0С, смешивают с антисывороткой и за-

ливают на стекло.

После застывания (через 5 минут) вдоль кромки слоя геля де-

лают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. В слое

геля создают электрическое поле, благодаря которому антиген

входит в гель. Зона преципитации приобретает вид "ракеток". Вы-

сота "ракеты", образующейся в результате реакции, прямо пропор-

циональна концентрации антигена (она измеряется от верхней гра-

ницы лунки до высоты пика).

6) _ 2Противоточный или встречный электрофорез . 0 (экспресс-диаг-

Реферат опубликован: 15/06/2005 (23206 прочтено)