Страница: 4/8
ностика вирусных и др. инфекций)
4Встречный ИЭФ (иммуноэлектрофорез) был применен Бендарид в
41969г. Электрическое поле усиливает способность к взаимодейс-
4твию низкореактогенных АГ и АТ. Чувствительность метода в 10
4раз превышает чувствительность метода двойной иммунодиффузии по
4Оухтерлони. /2400к/
Основное условие метода - наличие электрофоретической под-
вижности АГ.
┌─────────────────────────────────┐
2- 0 │ 0 │ 0 0 │ 2+
Катод │ АТ АГ АТ │ Анод
│ ПИК │
└─────────────────────────────────┘
В две лунки геля заливают антиген и антитела, пластину ста-
вят в камеру для электрофореза и включают напряжение. Электри-
ческим полем значительно ускоряется движение компонентов и ре-
акция преципитации проходит за 30-40 минут. Экспресс-диагности-
ка
7) _ 2Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)
┌───────────────────────────────────────┐ +
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │
└───────────────────────────────────────┘ -
1Постановка реакции:
│- В лунки заливается исследуемая смесь веществ,
│ пластина с агарозой ставится в электрофоретическую камеру
│ на ночь для разгонки белков.
│- Вынимается агароза из бороздок. В них заливается антисыво-
│ ротка (удобнее чередовать антицельную сыворотку с моноспе-
│ цифической к искомому компоненту). Ночь во влажной камере.
1Результат: 0 оценивается степень чистоты препарата по коли-
честву "лишних" дуг зон преципитации примесей с
антицельной сывороткой (если препарат получали из
крови).
5В геле, приготовленном на веронал-мединаловом буфере (рН
58,6), по трафарету делаются бритвой полоски и лунки. Гель из
5лунок вынимается (из бороздок нет) и лунки заполняют смесью ан-
5тигенов или исследуемой сывороткой. Пластина ставится в прибор
5для электрофореза и в течение ночи проводится разгонка исследуе-
5мых белков. На следующий день освобождаются от геля бороздки и
5заполняются моноспецифическими и полиспецифическими (часто ан-
5тицельной) антисыворотками. Пластина оставляется на ночь во
5влажной камере для реакции преципитации.
58) _Перекрестный электрофорез
5Смесь исследуемых белков разгоняется поперек пластины в
5электрическом поле, затем к полоске геля с разделенными белками
5приливается расплавленный гель с антисывороткой к исследуемым
5компонентам и разгонка проводится в продольном направлении.
5Формируются широкие отдельные зоны преципитации исследуемых
5компонентов белков.
3РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ
┌ ┐
│ 0 0 │ - хлопья флоккулята
│\ / \ / \ /│ (помутнение в пробирке)
│ │ │ │ │
└ ┘n
0 - молекула антигена (токсина или др.)
>── - молекула антитела
5В результате взаимодействия токсина или анатоксина с анти-
5токсической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее
5ранняя флоккуляция наблюдается в пробирке, где антиген и анти-
5тело содержатся в эквивалентных соотношениях.
5Одна флокуллирующая единица токсина (Lf - Limes flocculatio-
5nis) в 1 мл определяется минимальным количеством токсина, даю-
5щим начальную флоккуляцию с 1 международной единицей (МЕ) сыво-
5ротки.
52мл токсина (20 Lf в 1 мл) смешивают в пробирках с разными
5количествами сыворотки (0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл), инкубируют
530 минут при 45оС до выпадения хлопьев в одной из них. Если
5флоккуляция произошла в 3 пробирке, значит, в 0,4мл сыворотки
5находится 40МЕ. Следовательно, 1мл сыворотки содержит
540:0,4=100 МЕ. 0
3РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ
(ИФМ - иммуно-флюоресцентный метод)
1) _Прямой метод . иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на
взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, ко-
торый находится на клетке, в клетке или в тканях.
В качестве флюорохрома используют
- флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), дающий зеленое свечение в
УФ-ых лучах;
- тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) с оранжево-красным
свечением. /2551к/
┌────────────────────────┐ 4Y
│ 1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ
│ 1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома (светя-
│ │* │ щаяся в темном поле зрения
└────────────────────────┘ люминесцентного микроскопа)
Предметное стекло с препаратом
4(после промывки от несвязавшихся АТ)
1Постановка реакции:
│Фиксированный мазок
│+ диагностическая сыворотка с АТ-ми, мечеными ФИТЦ.
│Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате
│ видно свечение.
5Материал (препарат ткани, микроорганизмов или антигена) на-
5носится на стекло, фиксируется 15 минут в спирте или в пламени
5горелки, обрабатывается флуоресцирующей сывороткой (15-30 минут
5при комнатной температуре), промывается 15 минут физиологичес-
5ким раствором; проводится люминесцентная микроскопия. Отсутс-
5твие свечения свидетельствует об отсутствии антигена на препа-
5рате.
5Для получения флуоресцирующих антител к раствору иммуногло-
5булинов добавляют раствор флуоресцетина изотиоцианата натрия
5(можно 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид и изотиоцианат
5лизамин родамина В 200).
2) _Непрямой метод
┌────────────────────────┐ 4Y 0 >─── - АТ 42 0 (меченые
│ 1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ 41 0 флюорохромом)
│ 1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома
│ │>───* │
└────────────────────────┘
Предметное стекло с препаратом
4(после промывки от несвязавшихся АТ)
1Постановка реакции:
_1 вариант
│Фиксированный мазок больного (микробы больного)
│+ _диагностическая сыворотка . (обычные АТ; первого порядка),
│ допустим, кролика.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов кролика с АТ-ми
│ (второго порядка), меченными ФИТЦ.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате
│видно свечение.
_2 вариант
│Фиксированные мазки музейных микробов (диагностикума),
│+ (раститрованная) _сыворотка больного
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов (АТ второго поряд-
│ ка), меченными ФИТЦ.
│ Отмывка от несвязавшихся антител.
│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате
│видно свечение.
5Антисыворотку к иммуноглобулинам кролика получают иммуниза-
5цией барана иммуноглобулинами кролика.
5Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации
5риккетсий и других бактерий, вирусов, а также для определения
5рецепторов и АГ-ов животных клеток человека и животных.
3ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)
Реферат опубликован: 15/06/2005 (23331 прочтено)