Серологические реакции

Страница: 4/8

ностика вирусных и др. инфекций)

4Встречный ИЭФ (иммуноэлектрофорез) был применен Бендарид в

41969г. Электрическое поле усиливает способность к взаимодейс-

4твию низкореактогенных АГ и АТ. Чувствительность метода в 10

4раз превышает чувствительность метода двойной иммунодиффузии по

4Оухтерлони. /2400к/

Основное условие метода - наличие электрофоретической под-

вижности АГ.

┌─────────────────────────────────┐

2- 0 │ 0 │ 0 0 │ 2+

Катод │ АТ АГ АТ │ Анод

│ ПИК │

└─────────────────────────────────┘

В две лунки геля заливают антиген и антитела, пластину ста-

вят в камеру для электрофореза и включают напряжение. Электри-

ческим полем значительно ускоряется движение компонентов и ре-

акция преципитации проходит за 30-40 минут. Экспресс-диагности-

ка

7) _ 2Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)

┌───────────────────────────────────────┐ +

│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │

│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │

│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │

│ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о █ о │

│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │

│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │

│ █ █ █ █ █ █ █ █ █ │

└───────────────────────────────────────┘ -

1Постановка реакции:

│- В лунки заливается исследуемая смесь веществ,

│ пластина с агарозой ставится в электрофоретическую камеру

│ на ночь для разгонки белков.

│- Вынимается агароза из бороздок. В них заливается антисыво-

│ ротка (удобнее чередовать антицельную сыворотку с моноспе-

│ цифической к искомому компоненту). Ночь во влажной камере.

1Результат: 0 оценивается степень чистоты препарата по коли-

честву "лишних" дуг зон преципитации примесей с

антицельной сывороткой (если препарат получали из

крови).

5В геле, приготовленном на веронал-мединаловом буфере (рН

58,6), по трафарету делаются бритвой полоски и лунки. Гель из

5лунок вынимается (из бороздок нет) и лунки заполняют смесью ан-

5тигенов или исследуемой сывороткой. Пластина ставится в прибор

5для электрофореза и в течение ночи проводится разгонка исследуе-

5мых белков. На следующий день освобождаются от геля бороздки и

5заполняются моноспецифическими и полиспецифическими (часто ан-

5тицельной) антисыворотками. Пластина оставляется на ночь во

5влажной камере для реакции преципитации.

58) _Перекрестный электрофорез

5Смесь исследуемых белков разгоняется поперек пластины в

5электрическом поле, затем к полоске геля с разделенными белками

5приливается расплавленный гель с антисывороткой к исследуемым

5компонентам и разгонка проводится в продольном направлении.

5Формируются широкие отдельные зоны преципитации исследуемых

5компонентов белков.

3РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ

┌ ┐

│ 0 0 │ - хлопья флоккулята

│\ / \ / \ /│ (помутнение в пробирке)

│ │ │ │ │

└ ┘n

0 - молекула антигена (токсина или др.)

>── - молекула антитела

5В результате взаимодействия токсина или анатоксина с анти-

5токсической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее

5ранняя флоккуляция наблюдается в пробирке, где антиген и анти-

5тело содержатся в эквивалентных соотношениях.

5Одна флокуллирующая единица токсина (Lf - Limes flocculatio-

5nis) в 1 мл определяется минимальным количеством токсина, даю-

5щим начальную флоккуляцию с 1 международной единицей (МЕ) сыво-

5ротки.

52мл токсина (20 Lf в 1 мл) смешивают в пробирках с разными

5количествами сыворотки (0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл), инкубируют

530 минут при 45оС до выпадения хлопьев в одной из них. Если

5флоккуляция произошла в 3 пробирке, значит, в 0,4мл сыворотки

5находится 40МЕ. Следовательно, 1мл сыворотки содержит

540:0,4=100 МЕ. 0

3РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

(ИФМ - иммуно-флюоресцентный метод)

1) _Прямой метод . иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на

взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, ко-

торый находится на клетке, в клетке или в тканях.

В качестве флюорохрома используют

- флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), дающий зеленое свечение в

УФ-ых лучах;

- тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) с оранжево-красным

свечением. /2551к/

┌────────────────────────┐ 4Y

│ 1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ

│ 1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома (светя-

│ │* │ щаяся в темном поле зрения

└────────────────────────┘ люминесцентного микроскопа)

Предметное стекло с препаратом

4(после промывки от несвязавшихся АТ)

1Постановка реакции:

│Фиксированный мазок

│+ диагностическая сыворотка с АТ-ми, мечеными ФИТЦ.

│Отмывка от несвязавшихся антител.

│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате

│ видно свечение.

5Материал (препарат ткани, микроорганизмов или антигена) на-

5носится на стекло, фиксируется 15 минут в спирте или в пламени

5горелки, обрабатывается флуоресцирующей сывороткой (15-30 минут

5при комнатной температуре), промывается 15 минут физиологичес-

5ким раствором; проводится люминесцентная микроскопия. Отсутс-

5твие свечения свидетельствует об отсутствии антигена на препа-

5рате.

5Для получения флуоресцирующих антител к раствору иммуногло-

5булинов добавляют раствор флуоресцетина изотиоцианата натрия

5(можно 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид и изотиоцианат

5лизамин родамина В 200).

2) _Непрямой метод

┌────────────────────────┐ 4Y 0 >─── - АТ 42 0 (меченые

│ 1┌┬┬┐ 0 │ │ - АТ 41 0 флюорохромом)

│ 1└┴ 4Y 1┘ 0 │ * - метка флюорохрома

│ │>───* │

└────────────────────────┘

Предметное стекло с препаратом

4(после промывки от несвязавшихся АТ)

1Постановка реакции:

_1 вариант

│Фиксированный мазок больного (микробы больного)

│+ _диагностическая сыворотка . (обычные АТ; первого порядка),

│ допустим, кролика.

│ Отмывка от несвязавшихся антител.

│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов кролика с АТ-ми

│ (второго порядка), меченными ФИТЦ.

│ Отмывка от несвязавшихся антител.

│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате

│видно свечение.

_2 вариант

│Фиксированные мазки музейных микробов (диагностикума),

│+ (раститрованная) _сыворотка больного

│ Отмывка от несвязавшихся антител.

│+ Антисыворотка против иммуноглобулинов (АТ второго поряд-

│ ка), меченными ФИТЦ.

│ Отмывка от несвязавшихся антител.

│Люминесцентная микроскопия (при положительном результате

│видно свечение.

5Антисыворотку к иммуноглобулинам кролика получают иммуниза-

5цией барана иммуноглобулинами кролика.

5Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации

5риккетсий и других бактерий, вирусов, а также для определения

5рецепторов и АГ-ов животных клеток человека и животных.

3ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Реферат опубликован: 15/06/2005 (23204 прочтено)