Серологические реакции

Страница: 6/8

б) in vivo

1- 0Например, определение типа токсина Clostridium botulinum

при ботулизме. Клостридии ботулизма способны продуцировать 7

серотипов токсина - А,В,С,D,E,G,F, из которых в нашей стране

встречаются чаще токсин типа А, типа В и типа Е.

Допустим, человек отравился токсином Е:

│ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ РН│

├───┤ ├───┤ ├───┤

│ Е │ │ Е │ │ 2Е 0 │

└───┘ └───┘ └───┘

+ АТ к А + АТ к В + АТ к 2Е

│ │ │

мышь погибнет мышь погибнет мышь выживет

Токсин-содержащий материал разливают по 3 пробиркам и добав-

ляют в первую - антисыворотку к токсину А,

во вторую - антисыворотку к токсину В,

в третью - антисыворотку к токсину Е.

В 3 пробирке произойдет образование ИК, т.е. нейтрализация ток-

сина (РН). Для выявления данной пробирки содержимое вводят трем

мышкам. Третья мышь выживет.

1Минимальной летальной дозой токсина 0 считается количество

токсина. которое при подкожном введении морской свинке весом

250г вызывает ее гибель в течение 4-5 дней.

4) Феномен гашения сыпи (in vivo), например, при диагностике

скарлатины.

Для диагностики скарлатины в область наиболее обильной сыпи

вводят антисыворотку к эритрогенному токсину; если у больного

скарлатина, то сыпь в месте инъекции пропадает.

5) РН для определения напряженности антитоксического иммуни-

тета к дифтерийному токсину (проба Шика), скарлатинозному ток-

сину (проба Дика) в здоровом организме.

В область предплечья внутрикожно вводят определенное коли-

чество соответствующего токсина (1/40 DLM). При наличии в ога-

низме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина и реакция

будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов (антитоксичес-

ких АТ) в организме возникает воспалительная реакция (покрасне-

ние) на месте введения токсина. /2551к/

Подкожное введение эритрогенного токсина иммунным лицам при-

водит к нейтрализации токсина (покраснения не будет).

3РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

_ 5Реакции иммунного лизиса . используются в нескольких вариантах

51) Для определения АТ к эритроцитам барана (ЭБ)

52) Для определения HLA на В-лимфоцитах (лимфоциты + МАТ к

5определенному АГ системы HLA + комплемент --- лизис клеток +

5гемсистема - ЕА (эритроциты /Е/ барана, нагруженные антителами

5/А/ к ним /ЕА/). 6-12 ячеек из 100 будут с целыми эритроцитами,

5остальные - с лизированными (ИК нет, нет активации комплемента,

5нет потребления комплемента, свободный комплемента лизирует

5ЭБ). РСК.

53) Для определения титра АТ к любому АГ (РСК).

4В реакциях иммунного лизиса специфические АТ взаимодействуют

4с различными клетками, в том числе с бактериями и простейшими,

4что приводит к активации системы комплемента по классическому

4пути и последующему лизису клеток. Среди них известны реакции

4гемолиза и вибриолиза. /2400к/98/ 0

5Реакция гемолиза считается активной при использовании АТ к

5эритроцитам барана. При пассивной реакции иммунного лизиса про-

5изводят адсорбцию антигена на эритроцитах барана с последующим

5добавлением искомых антител к АГ-ну и комплемента. 0

2Определение титра антител по РСК

2(реакции связывания комплемента)

1/10 1/100 5 01/1000 5 и т.д. (раститровка)

= 10 5-1 0 = 10 5-2 0 10 5-3 0 5 010 5-4 0 10 5-5 0 10 5-6 0 10 5-7 0 5 0 10 5-7

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤

│ о │ │ о │ │ о │ │ о │ │ - │ │ - │ │ - │ │ - │ │ │

└───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘

\________________________/ \_________________________/ Контроли

Эритроциты барана целы Эритроциты барана лизированы

(муть или осевшие на дне)

1Постановка методики:

│- Раститровка сыворотки для определения титра АТ

│+ АГ (музейная культура микробов, лекарственный препарат,

│ анатоксин и пр. --- ИК в первых пробирках по убывающей

│+ комплемент (сыворотка морской свинки) --- связывание ИК с

│ C1q. Инкубация 15 минут.

│+ ЕА (гемсистема; другой вид ИК). Инкубация 15 минут.

│ --- Лизиса в первых пробирках нет, т.к. C1q весь связан с

│ первым типом ИК.

┌────┐ ┌────┐

│ АГ │ │ ЭБ │

└──┬─┘ ┌────┐ └──┬─┘

├────┤ С │ │ --- гемолиза эритроцитов нет

┌──┴─┐ └────┘ ┌──┴─┐ (положительная РСК)

│ АТ │ │ АТ │

└────┘ └────┘

ИК ИК [С- комплемент]

┌────┐ ┌────┐

│ АГ │ │ ЭБ │

└────┘ ┌────┐ └──┬─┘

│ С ├─────┤ --- гемолиз эритроцитов

┌────┐ └────┘ ┌──┴─┐ (отрицательная РСК)

│ АТ │ │ АТ │

└────┘ └────┘

ИК нет или мало ИК

(антител к искомому

АГ нет или мало)

1Примечание 0:

- Сыворотка больного предварительно инактивируется от собс-

твенного комплемента (56 5о 0 20 минут), поскольку активность комп-

лемента у разных больных разная (сбои в результатах).

- Предварительно отрабатывается рабочая доза АГ (не влияющая

сама по себе на реакции активации комплементарного каскада).

- Подбирается рабочая доза комплемента (избыток недопустим,

так как C1q будет оставаться и на ИК второго порядка).

51. Приготовление 5% суспензии эритроцитов барана (Е):

50,5 мл осадка отмытых эритроцитов + 9,5 мл физраствора.

52. Определение титра гемолитической сыворотки (антител /А/

5к эритроцитам барана):

5Титром гемолитической сыворотки считается максимальное раз-

5ведение в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз

50,5мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5мл компле-

5мента (1:10). Пробы выдерживаются при температуре 370С в тече-

5ние 1 часа.

53. Приготовление рабочего раствора гемолитической сыворотки

5(1:3):

5Например, исходный титр 1:2700; 2700 : 3 = 900, т.е. сыво-

5ротку необходимо развести в 900 раз (взять 1/900 часть от ко-

5нечного объема). Если надо 10 мл гемсистемы, то нужно взять

510:900=1/90мл=0,011мл исходной гемолитической сыворотки.

54. Приготовление гемолитической системы (индикаторной систе-

5мы для комплемента):

5Смешиваются равные объемы 5% суспензии эритроцитов барана и

5гемолитической сыворотки (1:6); при этом сыворотка при непре-

5рывном встряхивании выливается в суспензию эритроцитов, а не

5наоборот. Смесь встряхивается 5 минут и инкубируется 30 минут в

5термостате. Отмывается.

55. Определение рабочей дозы комплемента:

5В качестве источника комплемента можно использовать сыворот-

5ку здоровых доноров (при этом комплемент сыворотки инактивиру-

5ется прогреванием в течение 30 минут при 560С) или лиофилизиро-

5ванную сыворотку морской свинки.

5Титр комплемента - то наименьшее количество комплемента, ко-

5торое будучи смешанным с 0,5мл гемолитической сыворотки (в

5трехкратном титре), гемолизирует 0,5мл 3% взвеси эритроцитов в

5течение 30 минут.

5Для титрования пользуются основным разведением комплемента

51:10 и разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5мл. Затем в каж-

5дую пробирку добавляют физраствор до 1,5мл и 1 мл гемолитичес-

5кой системы. Инкубируют 30 минут при 370С и определяют титр

Реферат опубликован: 15/06/2005 (23205 прочтено)