Нейтрофилы

Страница: 2/9

В зрелых нейтрофилах существует два основных типа гранул: азурофильные и специфические. При воздействии на нейтрофилы растворимыми агонистами происходит дегрануляция нейтрофилов. Часть гранул, расположенных в близи плазматической мембраны сливается с мембраной и содержимое гранул высвобождается во внеклеточную среду. С наружной клеточной мембраной сливаются сначала специфические гранулы и уже затем – азурофильные. Такой тип дегрануляции характерен для «несостоявшегося фагоцитоза». При состоявшемся фагоцитозе бактерия захватывается мембраной нейтрофила со всех сторон, попадает в цитоплазму, где происходит её разрушение.

В нейтрофилах обнаружены универсальные механизмы передачи сигналов через G- белки, систему вторичных мессенджеров и фосфорилирование с участием протеинкиназ. G – белки представляют семейство гомологичных белков, плазматической мембраны, которые переносят информацию с рецепторов на ряд мембранных ферментов. Через G – белки действуют все агонисты, регулирующие активность аденилатциклаза, фосфолипазы А2, калиевых каналов. Фермент аденилатциклазы является интегральным белком плазматической мембраны, этот фермент отвечает за синтез сАМР в клетке. Одним из ранних событий после взаимодействия хемоаттрактантов с рецепторами является гидролиз мембранных фосфолипидов и образование биологически активных липидов. В процессе активации нейтрофилов участвуют три типа фосфолипаз: Фосфолипаза А2(PLA2), фосфолипаза С(PLC), фосфолипаза D(PLD) (Thelen et al. 1993).

Активация фосфолипазы С хемоаттрактантами осуществляется через G – белки. Фосфолипаза С расщепляет фосфолипид с образованием двух вторичных мессенжиров. Инозитолтрисфосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG). Инозитолтрисфосфат связывается с рецепторами на внутриклеточных запасниках кальция, локализованных вблизи плазматической мембраны. Связывание IP3 с рецепторами индуцирует высвобождение, Са++ из запасников и увеличение концентрации свободного Са++ в цитоплазме. Другой вторичный мессенжер диацилглицерин остается ассоциированным с плазматической мембраной и активирует протеинкиназу С (Omann et al. 1987, Thelen et al. 1993).

Механизм активации фосфолипазы А2 неизвестен.

Фосфолипаза D нейтрофилов Са++ зависима, она гидролизует фосфатидилхолин с образованием потенциального вторичного мессенжира – фосфатидной кислоты. Фосфатидная кислота расщипляется с образованием диацилглицерина – физиологического активатора протеинкиназы С. Процессы протекающие на плазматической мембране при взаимодействии легандов с рецепторами приводит к образованию в клетке низкомолекулярных продуктов циклических нуклеотидов, диацилглицерин, ионы кальция.

Циклические нуклеотиды не являются активаторами нейтрофилов, хотя кратковременное увеличение сАМР в нейтрофилах наблюдается при различных рецепторных активациях. Увеличение содержания сАМР угнетает двигательную активность нейтрофилов. (Галкин А.А. и соавт. 1994)

сАМР не блокирует быстрого увеличения внутриклеточного Са++ при активации нейтрофилов хемоаттрактантами. (Takenawa T., Ishitoya J., Nagai Y. 1986).

Дибутирильный сGMP сам по себе не вызывает активацию нейтрофилов и модулирует активацию нейтрофилов вызванную различными хемоаттрактантами сGMP в концентрациях в отличие от сАМР, значительно усиливает миграцию нейтрофилов (Галкин А.А. и соавт. 1994).

Ионы кальция основной частью находится в связанном состоянии и заключаются в ядре и митохондриях. При стимуляции нейтрофилов хемоаттрактантами происходит Са – зависимое кратковременное преходящее увеличение внутриклеточной концентрации Са++, которое обеспечивается из 2х источников; быстрого высвобождения Са++ из обмениваемого внутриклеточного источника и поступления Са++ извне. Извне Са++ поступает через плазматическую мембрану, проходит через рецепторуправляемые кальциевые каналы. Поддержание равновесия концентрации Са в клетке обеспечивается с одной стороны выведением Са++ из цитоплазмы кальциевыми насосами, с другой поступлением Са++ из окружающего раствора. Участие Са++ в регуляции активности нейтрофилов не ясно. Можно сказать, что подвижность нейтрофилов либо не связана с изменениями, либо связана с небольшими локальными изменениями внутриклеточной концентрации Са++.

Форболовые эфиры активируют нейтрофилы, вызывают дегрануляцию, респираторный взрыв, увеличение содержания F – актина без увеличения внутриклеточной концентрации Са++.

Диоцилглицерин вызывает активацию специфического фермента клеток протеинкиназ С. Протеинкиназа С активируется на короткое время, но последствия её активации имеют длительный характер.


Подвижность нейтрофилов

Лейкоциты способны двигаться в тканях и через стенки сосудов, а также по поверхности чужеродного субстрата (стекло). При движении клетка изменяет форму.

рис. 2 Движение нейтрофила по субстрату.

Двигательный акт у ползающих клеток начинается с образования на переднем конце клетки отростка - ламеллоподии, далее в выступ, образованный прозрачной бесструктурной цитоплазмой, переливается жидкая зернистая цитоплазма тела лейкоцита. Формирование отростков представляет активный процесс, т.к. движущая сила и энергия заложены внутри самой клетки. Отростки в зависимости от среды имеют разную форму, они могут быть в виде узких длинны микровыростов, уплощенных ламеллоподий, а также в форме пузырей (Адо А.Д. Патофизиология фагоцитов 1961). Ламеллоподии образуются спонтанно на всех краях клетки, но способность передвигать клетку приобретает та ламеллоподия, которая вступила в контакт с субстратом (Stossel T.P. 1993).. Контакты могут быть как с поверхностью другой клетки, так и с не клеточной поверхностью. Ламеллоподии могут быть как разной формы, так и разных размеров. Конец отростка, коснувшись поверхности, может образовать прочный контакт. Нейтрофил во время движения образует широкую псевдоподию на переднем конце и узкие отростки на боковых поверхностях клетки.

С помощью интерференционной микроскопии различают 2 области контакта. Двигаясь, нейтрофил образует область плотного прилипания, это хвост и боковые отростки клетки, а область менее плотного прилипания образуется с телом клетки. Так как лейкоцит способен двигаться по неклеточной поверхности (стеклу), то можно наблюдать, как клетка теряет часть мембранного и цитоплазматического материала в виде следа на стекле. Это свидетельствует о плотном контакте с субстратом. Чтобы ослабить плотность контакта надо увеличить концентрацию сывороточного альбумина (King C. et. al 1980).

Натяжение отростка примыкающего к субстрату подтягивает клетку и образует новый участок для контакта с субстратом. Реакции прилипания повторяются многократно и составляют процесс распластывания клеток (Васильев Ю.М., Гельфанд И.М. 1977). Отросток, который только что начал образовываться не может прикрепиться к субстрату (стеклу) (King C.A., Preston T. M., Miller R.H. Donovan P. 1980).

Затем идет реакция стабилизации, которая приводит к разделению края клетки на активные и неактивные участки. Разделение приводит к вытягиванию клетки в переднезаднем направлении и делает её асимметричной. Следовательно, движение клетки становится возможным лишь после возникновения асимметрии. Но до сих пор неясна роль бегущей волны сокращения от переднего края к телу клетки и общего сокращения кортикального матрекса в хвосте клетки. Некоторые авторы считают, что сокращения в области хвоста участвуют в продавливании цитоплазмы из тела клетки в ламеллоподию (Coates T.P. et. al 1992).

На заднем конце движущейся клетки есть хвост и ретракционные волокна. Хвост представляет скопление на конце клетки концов ретракционных волокон. Хвост нейтрофила адгезивен к субстрату и в нем наблюдаются сокращения. Образовавшаяся ламеллоподия вступая в контакт с субстратом создает натяжение в хвосте клетки, вызывая этим его отрыв от субстрата и перемещение клетки вперед. Когда перемещение клетки осуществилось, ламеллоподия исчезает и наступает кратковременное «покоящееся состояние». Затем снова начинают образовываться новые ламеллоподии и ретракционные волокна, и всё повторяется сначала (Нерсесова 1977).

Цитоплазма у нейтрофилов находится в постоянном движении. Когда клетка пребывает в состоянии покоя, то токи цитоплазмы беспорядочны, а когда клетка движется, они направлены внутрь ламеллоподии на ведущем крае.

Нейтрофил способен производить сокращения. Это предполагает наличие сократительных структур. Актин и миозин - белки, которые находятся в мышечных клетках. В нейтрофилах, которые не имеют мышечных структур, тем не менее, есть белки сходные с актином и миозином. Актиноподобный белок очень похож на мышечный актин по молекулярному весу, структурной организации, способности активировать миозиновую АТФазу, связываться с миозином. У клеток, которые имеют не мышечную подвижность, актин вместе с миозином составляет сократительную систему, но при этом актин выступает как структурный белок. В не мышечных клетках 50% актина находится в неполимеризованной форме (G – актин), а в мышечных клетках актин на 100% полимеризован (F – актин). Такое содержание актина G и F в не мышечных клетках обусловлено взаимодействием актина с актин – связывающими белками. Известно более 100 актин связывающих белков. Альфа – актинин сшивает филаменты F – актинового геля. Другой важный белок это гельзолин. Он принимает участие в локомоции (движение обеспечивающее активное перемещение в пространстве) и транспорте везикул (пузырьков) через кортекс.

Миозиноподобные белки составляют очень малый процент (от 0.2-0.8% от общего содержания белков клетки). Молярное отношение актина к миозину в полиморфно-ядерных лейкоцитах составляет 100:1. (Crawford N., Chahal., Jackson P. 1980) Миозиноподобные белки являются ферментами, они обладают АТФазной активностью и способностью соединяться с актином. (Красовская И.Е. 1977; Omann G. M. et al 1987).

Предполагается, что в области псевдоподий актин деполимеризован. Асимметрия F – актина возникает ещё в неполяризованных клетках при активации их хемоаттрактантами и предшествует возникновению клеточной асимметрии. Снижение содержания F – актина уменьшает жесткость актинового каркаса клетки и каркас продавливается в области где произошла деполимеризация актина. Начальная реакция полимеризации актина не зависит от концентрации Ca++ в нейтрофилах, а реакция деполимеризации актина зависит от внутриклеточного Са++. Вторая фаза полимеризации актина зависит от концентрации внутриклеточного Са++ и возможно связана с функциями нейтрофила, такими как респираторный взрыв и дегрануляция. Одновременно с полимеризацией актина при действии хемоаттрактантов происходит фосфорилирование миозина. Фосфорилирование миозина и обнаружение миозина в области псевдоподии указывает на участие сократительного аппарата в образовании псевдоподии. (Omann G.M. et. al 1987)


Методы исследования подвижности нейтрофилов

Впервые скорость движения отдельных нейтрофилов измерил McCutcheon в 1923 году.

В 1962 году Boyden разработал метод количественной оценки подвижности популяции нейтрофилов. Метод заключается в миграции лейкоцитов через тонкий фильтр, который разделял камеру на два отсека. В верхний отсек помещали суспензию клеток, клетки оседают на фильтр и переходят через поры в нижний отсек. Размер пор для нейтрофилов 3 мкм, для эозинофилов 5 мкм, для макрофагов 8 мкм. Чтобы оценить хемотаксис нейтрофилов, нужно нижний отсек заполнить раствором содержащий хемоаттрактант. Этот метод эффективен в оценке хемотаксиса, но не случайного блуждания т.к. движение лейкоцитов не является свободным. Недостаток этого метода в том, что он не позволяет наблюдать клетки в процессе движения, а оценка двигательной активности по самым подвижным клеткам популяции.

В 1975 году был изобретен новый метод исследования подвижности под агарозой. Чашки Петри заполняются горячим раствором агарозы в физиологическом растворе. При застывании раствора образуется гель, в котором проделывают лунки до дна чашки, а в лунки помещают суспензию клеток. Клетки начинают двигаться через лунки на дно чашки Петри под гель, по радиусу разбегания оценивается свободное блуждание. Если надо исследовать хемотаксис, то рядом с первой лункой делают ещё одну, в которую помещают раствор хемоаттрактанта. Агарозный гель полупрозрачен и можно наблюдать через микроскоп за живыми клетками. Недостаток метода является длительное время инкубации для получения картины разбегания клеток из лунки.

При использовании методов, описанных выше, необходимо проводить дополнительные исследования для различения случайного блуждания, хемотаксиса или хемокинеза. Такие методы исследования не дают возможности изучать отдельные клетки во время движения.

В 1953 году Харрис впервые использовал автоматический метод съемки движущихся нейтрофилов. Этот метод был использован в клинических исследованиях.

Полностью автоматизированные методы появились, когда были решены проблемы оптического выделения объектов и были созданы программы слежения за движущимися клетками (Туманов и соавт. 1990). В исследовании подвижности нейтрофилов важен выбор межкадрового интервала. В экспериментах (Hartoman R. S. el al 1994), средняя скорость движения при интервалах регистрации 4 сек. была 17 мкм/мин., а при интервалах 36 сек, составляла 9.9 мкм/мин. Отличие связано с тем, что размер нейтрофила составляет 10 мкм, а время нужное на перемещение равное клеточному диаметру приблизительно равно 1-1.5 минут. Поэтому для оценки внешнего движения используют 1 минутный межкадровый интервал, нейтрофилы за этот интервал времени перемещаются в среднем на величину клеточного диаметра. Такая регистрация позволяет оценить воздействие химических и физических факторов на подвижность нейтрофилов, проводить сравнение в норме и патологии.

Регистрация внутреннего движения используется для более подробного исследования изменений подвижности. Для этого выбирается межкадровый интервал такой, чтобы при непрерывном измерении перемещение центра массы клетки, связанное с изменением формы клетки за время межкадрового интервала не превышало клеточного диаметра (Hartman R. S. Lau K. Chou. W. Coates T. D. 1994).

Анализ траекторий случайного блуждания клеток, которые регистрируют с интервалом 2 сек. показывает, что поведение клеток отличается на малых и больших временах наблюдения. По степени корреляции разделяют два вида траектории движения:

Персистентное движение – клетка некоторое время пытается сохранить величину и направление движения.

Диффузионное движение – связано с внутренними процессами в клетке стремящимися изменить направление движения клетки.

Среднее время перехода между этими двумя формами движения называется характерным временем или временем персистентного движения (Tranquillo R.T. at al 1988).

Движение нейтрофилов изучали на покровных стеклах. Движение клеток происходит по определенной траектории, у каждой клетки она своя. Форма траекторий разнообразна, от плотного клубка до расплетенных нитей. Нейтрофилы бывают: медленные, средние и быстрые. Медленные – это клетки, которые вытягивают ламеллоподии в разные стороны, но в результате отсутствия скоординированного двигательного акта они стоят на месте или движутся но очень медленно. Средние клетки имеют траекторию более запутанную в виде плотного клубка из-за того, что они больше стоят на месте и углы поворотов у них больше. Быстрые клетки имеют меньшие углы поворотов и меньше времени стоят на месте, следовательно, их траектория более прямая. Такой вывод был сделан по произвольно выбранным клеткам. Время пребывания в фазе активности и углы поворотов определяются внутренней программой клетки.

Подвижность нейтрофилов может служить показателем тяжести состояния больных с раневой инфекцией.

Табл. 1 Средняя скорость движения и процентный состав нейтрофилов в группах здоровых доноров и больных с раневой инфекцией.

ГРУППЫ

СКОРОСТЬ

мкм/мин

МЕДЛЕННЫЕ

%

СРЕДНИЕ

%

БЫСТРЫЕ

%

ЗДОРОВЫЕ

8.8 ± 0.2

16

28

56

СР. ТЯЖЕСТИ

6.5 ± 0.3

27

34

39

ТЯЖЕЛЫЕ

3.3 ± 0.3

58

27

15

Реферат опубликован: 23/05/2005 (30735 прочтено)