Интерстициальные клетки Кэйждела

Страница: 2/3

Время необходимое для исчезновения медленных волн также зависит от длительности инкубации в МС. Когда препараты ИКК-ЦМ инкубировались в МС в течении 7 минут с последующим периодом прмывки 5 минут, иллюминация с максимальной интенсивностью устраняла медленные волны через 4-8 минут (n=5). Эффекты МС и света были необратимы.

Эффекты МС и света на ЦМ препараты: Специфичность действия МС изучалась с использованием ЦМ препаратов, которые не содержат подмышечной сети ИКК. Инкубация в МС в течении 45 минут не вызывала эффектов на электрических параметрах препаратов ЦМ, находящихся в покое (мембранный потенциал покоя=-62,8 мВ), так же не было эффектов при иллюминации с максимальной интенсивностью в течении 6 минут (n=4), что было вдвое больше максимального количества времени, требуемого для упразднения медленных волн в ИКК-ЦМ препаратах в тех же условиях.

Принимая во внимание тот факт, что способность препаратов ИКК-ЦМ к генерации медленных волн была избирательно устранена МС и светом, подобная активность ЦМ препаратов не была устранена. После обработки МС и светом и промывки раствором Кребса, добавление BaCl 2 (0,5 мМ) и BAY K 8644 (0,1 мМ) снижает мембранный потенциал покоя до –46,1 мВ и вызывает появление шипоподобых потенциалов с частотой, амплитудой и длительностью соответственно:18,7 циклов/мин; 16,5 мВ; 1,6 с. Частота потенциалов действия была снижена, когда клетки были реполяризованы потенциалом величиной 8-12 мВ и полностью упразднялась реполяризацией клеток к той же величине потенциала покоя каким он был в растворе Кребса. Эти наблюдения были типичны для ЦМ препаратов в присутствии BaCl2 и BAY K 8644.

Структурная корреляция.

Световая микроскопия. Инкубация в 50 ммоль МС в течении 7 минут не вызывала видимого впитывания красителя лоскутами (n=12), в то же время 45 минутная инкубация приводила к отчётливому окрашиванию всех лоскутов (n=1-). Эти образцы были отчётливы особенно в участках , где резидуальный подслизистый слой был очень тонким. В первых экспериментах авторы установили полную утрату окрашиваемых ИКК, когда внутрення поверхность ЦМ слоя была извлечена из препарата вместе с подслизистой соединительной тканью. Вот почему во всех экспериментах, субмукоза была отделена как можно полнее ножницами, с минимальным механическим растяжением.

После 45 минутной инкубации МС окрашивание было также обнаружено кроме ИКК и небольшого количества аксонов, в эритроцитах внутри капилляров и венул, в тучных клетках в субмукозе и в интерстиции ЦМ. Гладкомышечные клетки не окрашивались. В 1мм срезах ЦМ были контрастны во всех МС окрашенных лоскутов, что определялось недостаточным количеством клеток. Ткани хорошо сохранялись. ХотяИКК-ЦМ препараты, которые были преинкубированы МС в течении 7 минут не показали видимого окрашивания, контрастность подмышечного ИКК слоя уменьшалась после иллюминации с максимальныой интенсивностью в течении 4010 минут как было установлено в случае окрашивания толуидином синим. Эти наблюдения коррелировали с ультраструктурными изменениями.

Электронная микроскопия: Контрольные данные – иллюминация без МС никаких ультраструктурных изменений не было обнаружено в ИКК-ЦМ препаратах (n=11, 2-10 мин иллюминация), которые освещались в течении 10 минут с максимальной интенсивностью без инкубации в МС. Три типа клеток, интимно связанных щелевыми соединениями и промежеуточными контактами присутствовали вдоль всего внутреннего края препаратов. ИКК соединяются с тонкими ветвистыми гладкомышечными клетками (ВКМК), которые в свою очередь формируют щелевые контакты и межуточные соединения с глубоко лежащими крупными клетками ЦМ.

Взаимодействие между этими типами клеток было важным, так как авторы обнаружили, что окрашивание МС и заметное повреждение после инкубации в МС и иллюминации были ограничены для ИКК, более чем для ВГМК и типичных гладкомышечных клеток. Хотя индивидуальный профиль клеточных отростков часто было невозможно классифицировать, то три типа клеток могут быть классифицированы сравнением ядерных частиц клеток:

ИКК были высоко разветвлёнными клетками с 2 или 5 первичными отростками, профили клеток, которые включали ядро, в соновном также содержали начало 1 или 2 первичных отростков. Перинуклеарная цитоплазма между началом отростков была очень тонкой. В начале отростков перинуклеарная цитоплазма доминировала большой аккумуляцией митохондрий. Часть цитоплазмы была занята узлами филамент с малыми тельцами ассоциированными с цитоплазмой и мембраной. Когда последние сравнивались с расположением плотных телец в гладкомышечных клетках (ЦМ и ВГМК), оказалось, что в цитоплазме ИКК их мало. Разбросанные микротубулы всегда присутствовали в перинуклеарной цитоплазме. Обширный эндоплазматический ретикулум состоял из системы переплетающихся соединённых между собой цистерн, организованных частично между и вокруг митохондрий, частично соединённых с тонкими цистернами. Цистерны были преимущественно тонкого типа, с грубой частью, характеризуемой широко разбросанными рибосомами.

Выше перечисленные черты были типичны для ИКК, но не для ВГМК или ЦМ. В ВГМК и ЦМ митохондрий было меньше и они были беспорядочно разбросаны. Профили подобные тем, что изображены на фотографиях 5а и 6а были типичны в случае, если плотность митохондрий в ВГМК меньше соответствующей величины в ИКК. Перинуклеарная цитоплазма была заполнена плотно расположенными филаментами (тонкого, толстого и промежуточного типов) со схожей структурой плотных телец (ассоциированные с цитоплазмой и мембраной) в ВГМК и ЦМ. ВГМК может быть отличена от ЦМ размером (более тонкие области перинуклерных филамент и более тонкие отростки у ВГМК) и нерегулярным появлением ветвистости в ВГМК. Ядерная морфология была схожей в ИКК, ВГМК и ЦМ.

Хотя могут обнаруживаться некоторые вариации ультраструктур при осмотре полусерийных срезов, профили больших отростков трёх типов клеток в общем могут быть классифицированы по критериям перечисленным выше.

Ультраструктура после инкубации в МС.

Целостная структура клеток и субклеточные детали не поражались МС как указывалось прежде. После 7 минутной инкубации в МС, во всех 3 типах клеток не обнаруживалось каких-либо изменений. Единственным постоянным изменением, наблюдавшимся во всех препаратах был переход митохондрий от конденсированной (расширенные внутрикристовые пространства и плотный матрикс) к ортодоксальной конформации (узкие кристы и разреженный матрикс) в ИКК. В противоположность этому, у гладкомышечных клеток митохондрии находились в различной конформации до и после обработки МС и светом. Никаких доказательств в пользу конформации митохондрий в гладкомышечных клетках (ГКМ) получено не было.

После инкубации в МС иллюминация в течении 4 и 10 минут вызывала серьёзные повреждения в ИКК и малом количестве ГКМ разбросанных по краю подмышечного слоя. После 4 минутной иллюминации самыми выдающимися изменениями в ИКК были увеличение митохондрий и увеличение вакуолизации цитоплазмы (n=3). После 10 минут иллюминации (n=3, фотографии 6в) ИКК были увеличенными имели низкую контрастность цитоплазмы, отлично различимые митохондрии, несколько кавеол и отверстия в плзматических мембранах, что вероятно говорило о её разрыве. Идентификация ИКК была возможной благодаря сохранению базальной пластинки и совместно с чертами цитоплазмы (такими как число митохондрий) и сохранению взаимосвязей с глубоколежащими клетками.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Избирательное повреждение толстокишечных ИКК метиленовым синим и светом.

Авторы установили строгую очевидность того, что подмышечные ИКК незаменимы в генерации потенциалов действия медленных волн в ЦМ толстого кишечника собак непосредственно показав связь между избирательным повреждением ИКК и исчезновением медленных волн при этом. В свежих исследованиях авторы показали, что ИКК в подмышечном сплетении избирательно аккумулируют МС и что МС не вызывает каких-либо микроскопически заметных изменений в любых типах клеток, кроме он не имеет значительного эффекта на активность медленных волн. В настоящем исследовании авторы показали, что интенсивная иллюминация после инкубации в МС приводит к специфическому повреждению ИКК подтверждаемому элетронной микроскопией. Более того, когда ЦМ препараты, у которых были удалены подмышечные ИКК-ГМ сети, были инкубированы в МС с последующей иллюминацией , спонтанная и индуцируема электрическая активность не затрагивалась. Эти наблюдения указывают на то,что эффекты МС и света на ИКК-ЦМ препараты были специфичны только для ИКК, не связанных с ГМК.

Хотя устранение активности медленных волн МС и светом сопровождалось деполяризацией, последняя не была ответственна за ингибирование активности медленных волн, с того момента, как реполяризация клеток к их прежнему потенциалу покоя не восстанавливала медленные волны. Кроме того, было замечено, что медленные волныустраняются в большом диапозоне величин мембранных потенциалов, включая мембранный потенциал покоя, свойственный циркулярным мышцам, что указывает на , что изменения активности медленных волн не вызваны изменениями величин мембранных потенциалов. В противоположность этому, строфантин также деполяризует мембраны и при этом устраняет активность медленных волн (1). Тем не менее, реполяризация мембран к изначальному потенциалу покоя полностью восстанавливает активность медленных волн. Это указывает на то, что в присутствии строфантина, ингибирование активностимедленных волн - непосредственный эффект деполяризации.

Локализация аккумуляции МС внутри ИКК очень специфична. Когда преципитация МС была проведена так, что удалось избежать перемещения и образования грубых преципитатов было обнаружено, что электронно-плотные депозиты присутствуют только в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и его нет в других цитоплазматичексих компонентах (35). Это может указывать на то, что МС входит в ЭР непосредственно путём проникновения через пгладкие цистерны. Тем не менее, остаётся неясным почему МС накапливается в ЭР ИКК, но при тех же обстоятельствах не входит в ЭР ГМК. В опытных условиях настоящего исследования, изменения в конформации митохондрий так же как активности медленных волн были обнаружены при минимальной инкубации МС в течении 7 минут и минимальной иллюминации в течении 2 минут, что наводит на мысль о том, что первичной причиной устранения медленных волн является повреждение митохондрий.

Фотодинамическое цитотоксическое действие МС было известно многие годы (2). Недавно изучалась цитотоксическая эффективность фотоинактивации МС-чувствительных клеток рака желчного пузыря (10), включая и сопровождающие её ультраструктурные изменения (39). После короткого периода иллюминации (5 минут), докладывалось, что ультраструктурные изменения были идентичны данным авторов (дизинтеграция митохондрий и ранние признаки повреждения плазматических мембран) , а высокая продолжительность иллюминации вела к разрыву мембран клеточной фрагментации. В исследования фотодинамического действия МС на ДНК (23) было показано, что обратимые предповреждения ДНК, вызванные МС в темноте становятся необратимыми когда к инкубации в МС присоединяется иллюминация. Вот и в этом исследовании электрофизиологические эжффекты и ультраструктурные эффекты МС и света также были необратимыми.

Роль ИКК в генерации медленных волн.

Настоящее исследование подкрепляет гипотезу о том, что ИКК незаменимы для генерации активности водителя ритма в кишечнике. В подобных исследованиях, использующих тонкий кишечние мышей иллюминация светом красного лазера устраняла внутриклеточно записанную активность медленных волн после инкубации в МС (36). Было показано, что активность медленных волн поражается в препаратах где ИКК окрашивались МС и не поражается, где ИКК не окрашивается. В другом исследовании (37), спонтанная сократительная активность медленных волн была сохранена, когда в культурируемых кусочках мускулатуры тонкого кишечника мышей окрашенные МС ИКК были просмотрены под микроскопом в очень тусклом свете, но эти кусочки быстро становились неподвижными при сильном освещении.

Настоящее исследованиеспецифически устанавливает решающую роль ИКК в генерации медленных волн в толстом кишечнике собак как показывалось прежде (12,18,19,21,29). Авторы выдвигают гипотезу о том, что циклическая внутриклеточная активность периодически активирует токи водителя ритма. В этом случае ИКК могут являться или биохимическими часами или одновременно биохимическими часами и ионными каналами, отвечающими за генерацию тока водителя ритма. Хотя спонтанные осциляции, записанные в изолированных ГМК (25) и клетках близких по описанию к ИКК (17,26), и устранялись блокаторами кальциевых каналов L-типа и следовательно не отражают медленные волны, как компонент водителя ритма, которые в принципе этими блокаторами не устраняются (14). Таким образом, спонтанно происходящие осциляции не имеют характеристик медленных волн.

Следующий вопрос касается роли ГМК в генерации медленных волн, как компонента водителя ритма. Ветвистые ГМК, которые интимно соединяютс с ИКК соединительными щелями представляют особый интерес. Если ИКК единственные клетки ответственные за генерацию токо водителя ритма, то величина тока, которую каждая ИКК должна генерировать, чтобы деполяризировать все соседствующие с ней клетки с высоким сопротивлением поверхности, должна быть огромной. Возможно и другое: ИКК – это биохимические часы и ИКК посылают внутриклеточные метаболиты через соединительные щели в интимно соединённые с ними ГМК. Благодаря такой метаболической связи (8) ассоциированные ГМК могут находиться в синхронии с ИКК, когда каналы водителя ритма и в ИКК и в ассоциированных с ними ГМК – активированы. Обоснование этой части гипотезы требует идентификации каналов водителя ритма и доказательства существования таких каналов в ИКК и ГМК. Интересен тот факт, что в присутствии тетраэтил аммония, BaCl2 и карбохола, изолированный слой ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК генерирует потенциалы действия, которые идентичны по частоте с медленными волнами, но устраняются блокаторами кальциевых каналов L-типа (D-600) (18). Это и последующее исследование (20) показали, что ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК может генерировать потенциалы с характеристиками подобными активности медленных волн.

Активность медленных волн также исчезает после обработки тканей Родалином 123 в полнослойных препаратах мышц (38). Родалин 123 – специфический маркёр митохондрий, и таким образом он не специфичен для ИКК, хотя ИКК особенно богаты митохондриями. После проникновения в митохондрии, Родалин 123 становится цитотоксичным благодаря разрушению АТФ (24). Следовательно, эффект Родолина 123 наводит на мысль о том, что активность медленных волн находится в строгой зависимости от внутриклеточного метаболизма. Это согласуется с наблюдениями о том, что активность медленных волн чувствительна к высоким температурам (1), блокируется ингибиторами метаболизма, такими как динитрофенол и карбонил цианид (H. Preiksaitis и J.D. Huizing, неопубликованные данные) и поражается при изменении конформации митохондрий (настоящее исследование). Это поддерживает гипотезу авторов о том, что компонент медленных волн водителя ритма образуется благодаря внутриклеточному метаболизму.

Таблицы, графики и изображения.

Таблица 1. Эффекты инкубации в 50 мМ метиленового синего (45 минут) на электрическую активность препаратов ИКК-ЦМ с или без иллюминации

Параметры

В растворе Кребса

+Метиленовый синий

+Свет

Мембранный потенциал покоя, мВ

-72,8+-0,8

-70,6+-0,9

-47,3+-1,9

-69,7+-1,6

Частота, циклов/минуту

5,3+-0,2

5,0+-0,2

Продолжительность, с

Амплитуда действия, мВ

3,8+-0,3

38,6+-1,4

4,9+-0,7

37,4+-1,5

Амплитуда плато, мВ

34,1+-1,3

33,2+-1,6

Частота колебаний, мВ/c

192,3+-23,8

169,4+-18,7

Реферат опубликован: 11/04/2005 (6429 прочтено)