Страница: 4/5
-высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь нуклеотидной последовательностью, применяемой в данной диагностической системе;
-высокой чувствительностью, позволяющей диагносцировать не только острые, но и латентные инфекции (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);
-химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов,
-возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 часов.
Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в холодовом термоконтейнере или термосе со льдом. Важной отличительной особенностью ПЦР-диагностики является относительно низкая стоимость оборудования для проведения анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что позволяет выявлять весь спектр клинически актуальных инфекционных агентов.
ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). Следует иметь не менее двух комнат
-пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении), в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.
-пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации, в ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.
В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории должны обрабатываться дезинфицирующими растворами .
Показания для диагностики С. trachomatis методом ПЦР
1. Острая фаза заболевания
2. Хроническая фаза заболевания
3. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.
4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. 5 Бесплодие неясного генеза.
6. Контроль эффективности проведенного антибактериального лечения.
В случае выявления фрагмента ДНК хламидии трахоматис после курса химиотерапии следует провести культуральную диагностику для исключения “ложноположительного с клинической точки зрения результата”. Если проведение культуральной диагностики невозможно, то необходимо через 5-6 недель (полное обновление эпителиального покрова мочеполовых путей) провести повторное исследование методом ПЦР.
7. Выявление хламидии у ВИЧ-инфицированных лиц, больных туберкулезом, вирусным гепатитом и со вторичными иммунодефицитными состояними (онкологические больные после курсов химио- и лучевой терапии, трансплантации костного мозга, получающие иммуносупрессивную терапию).
В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от компании Cetus права и патенты на использование ПЦР. В этом же году была создан Roche Molecular Systems, занимающийся исключительно вопросами развития и совершенствования ПЦР. В 1992 году были внедрены первые стандартизованные тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато производство этих тест систем. Многочисленные проведенные исследования показали высокую чувствительность и специфичность данного набора. Это позволило получить данной тест-системе сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одновременной их детекции в одной пробирке. В тесте использованы биотинилированные праймеры (СР24/СР27) из криптической плазмиды С. trachomatis. Чувствительность теста составляет 10 копий/мл, специфичность 99,6%. Тест-система включает: набор для сбора и транспортировки образцов, набор для выделения ДНК из цервикальных, уретральных образцов и мочи, набор для амплификации и детекции. Все наборы стандартизованы, полностью готовы к использованию, имеют внутренний контроль, систему защиты от контаминации.
Научно-производственной фирмой "Литех" при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор реагентов "Полимик" в виде трех отдельных наборов для определения соответственно Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор “Полимик” комплектуется отдельным набором для выделения ДНК из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от 18.03.96 г.) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г. (ТУ 9398-405-17253567-96).
В состав реакционной смеси набора “Полимик” входит внутренний контроль (рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент-вставку размером 308 н.п.). Этот компонент позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих ПЦР. Полоса, соответствующая внутреннему контролю, должна проявляться как в положительном и в отрицательном контролях, так и во всех тестируемых пробах.
При выделении ДНК из биопробы (“Набор для выделения ДНК”) используется метод экстракции ДНК из клеток хламидий с помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся нуклеиновых кислот с частицами крупнопористого стекла. Это позволяет оптимизировать условия выделения и подготовки проб для амплификации, а также уменьшить количество манипуляций с образцом. При этом все манипуляции проводятся в одной пробирке. Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% по результатам определения числа колониеобразующих единиц клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм, взятый в качестве стандарта) как в случае чистой культуры, так и при добавлении этих клеток к клиническому материалу, не содержащему определяемых инфекционных агентов.
После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.
Анализ результатов диагностики
1. В положительном контрольном образце для хламидий выявляется полоса размером 501 н.п.
2. В отрицательном контрольном образце полоса, соответствующая фрагментам генома хламидий, должна отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов набора.
3. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии хламидий в клинической пробе.
4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного цвета, соответствующая внутреннему контролю размером 308 н.п. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра. При использовании видеосистемы "Gel-doc" возможно документирование результатов электрофореза в виде компьютерного файла, доступного любым приложениям “Windows”.
Набор “Полимик” следует хранить при температуре - 18-20 ° С в течение всего срока годности (6 месяцев). Допускается, хранение и транспортировка набора при температуре не выше 0 ° градусов не более одних суток.
По состоянию на третий квартал 1999 г. Минздравом России помимо набора “Полимик” разрешены следующие диагностические наборы для обнаружения хламидий трахоматис методом ПЦР в качестве изделий медицинского назначения:
набор реагентов амплификационный для определения ДНК хламидий (Хламидия-Ампли-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 производства АО “ВНЦМДЛ”, Москва;
набор реактивов для выявления нуклеотидных последовательностей хламидия трахоматис методом ПЦР (Хлам Ам) ТУ “9398-403-29032954-96 производства ЗАО “Внедрение систем в медицину”. Москва,
набор реагентов для выявления ДНК хламидий трахоматис методом ПЦР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 производства НПФ “ДНК-технология”, Москва.
Достоинства и недостатки различных методов обнаружения Chlamydia trachomatis
(Taylor-Robinson О., Thomas B.J ,1991, с дополнениями Говорун В.М, Бочкарев Е.Г., Парфенова Т.М., 1999)
Характеристика/ Метод
ПИФ
Культуральный посев
ИФА-методы
ПЦР
Исследуемый материал
Любой
Большинство
Ограничения из-за неспецифичности реакций
Любой
Значение правильно взятых проб
Решающее
Решающее
Решающее
Решающее
Условия транспортировки проб
Если препарат фиксирован -условия не важны
Быстрая доставка или хранение при низкой температуре
Не имеет значения, если проба взята в буфер
Быстрая доставка или хранение при низкой to менее важно, чем для культуры клеток
Условия хранения
На короткое время при +4°С длительно при -20 °С
+4°С - сутки-двое. Длит хранение в жидком азоте
3 -5 дней при +4°С Замораживание снижает чувствительность
На короткое время + 4°С, две недели - 20°С Длительное время - в жидком азоте
Проверка адекватности взятия материала
Мазки оценивают во время тестирования
Не практикуется
Не практикуется
Определяется, присутствует ли ДНК.
Потребность в специальном оборудовании
Люминесцентный микроскоп
Реферат опубликован: 16/06/2005 (10665 прочтено)