Хламидиоз. Методы определения, диагностики

Страница: 3/5

Имеется

Показано

Таблица 15. Хроническая персистенция антител без клинических проявлений. Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней.

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

<100

50-100

<50

Присутствует персистирующие хламидии, вызывающие образование IgA-антител. Клининическое значение неизвестно.

Не показано

В случае обследования реконвалесцентов или при выявлении повышенных титров IgG, расценивающихся как “серологическая находка” (табл. 16), динамическое наблюдение через две недели в случае отсутствия 4-х кратного повышения титра Ig G позволяет вынести заключение о неинфицированности и непоказанности антибактериального лечения (табл. 17)

Таблица 16. Состояние после реконвалесценции - “остаточная серология” (сомнительно). Пограничные титры в первой сыворотке.

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

>=10

<50

<50

Сомнительно необходимы проведение ПЦР, культ. посева

Сомнительно

Таблица 17. Состояние после реконвалесценции - “остаточная серология”. Диагностические титры во второй сыворотке через 10-14 дней.

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

>=100*

<50

<50

Отсутствует

Не показано

* - в случае отсутствия 4-х кратного повышения титра между первой и второй сыворотками. Если это повышение имеется, то отмечается текущая инфекция.

С января 1999 г. на российском рынке появились тест-наборы С. trachomatis Ig G и Ig A pELISA medac. Они используют синтетический пептид из иммунодоминантной области МОМР. С помощью этого высокоспецифичного антигена возможно выделение С. trachomatis - специфических антител с высокой чувствительностью среди общих антихламидийных антител с высокой степенью чувствительности.

Преимущества теста:

-отсутствие ложноположительных результатов, обусловленных межвидовой перекрестной реакцией хламидий;

-отсутствие инфицированного антигенного материала;

-химически точная структура антигена;

-наличие стрипов позволяет экономично использовать тесты;

-пригоден для использования на автоматических открытых системах для ИФА.

ЗАО "Вектор-Бест" (Новосибирск) производит следующие тест-системы для диагностики хламидиоза методом ИФА:

- ХламиБест-Ig G-стрип для выявления иммуноглобулинов классов G к С. trachomatis и С. psittacci в сыворотке крови ;

- ХламиБест-Trachomatis Ig G-стрип. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к Chlamydia trachomatis в сыворотке (плазме)крови;

-ХламиБест-Ig M - стрип. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к Chlamydia trachomatis и Chlamydia psrttaci;

- ВектоХлами-антиген-стрип. Тест-система для выявления антигена Chlamydia trachomatis. Хромоген-ОФД.

-ВектоХлами-антиген-стрип. Тест-система для выявления антигена Chlamydia trachomatis.

Имеются реактивы различных фирм для экспресс-диагностики хламидийной инфекции, учет реакции через 10-15 минут визуальный. Однако чувствительность этих методов невысока - 50-60%, они могут быть использованы только для скриннинговых исследований.

Диагностика хламидий на культуре клеток МсСоу

Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким является метод диагностики хламидий путем изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (“золотой стандарт”) Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. В литературе описаны случаи выявления хламидий трахоматис методом ПЦР при отрицательных результатах культурального теста и наоборот.

Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются:

1 Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.

2. Оценка эффективности проведенного антибактериального лечения.

3. Выявление чувствительности и резистентности к антибактериальным

препаратам.

4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, трансплантации костного мозга; лица, получающие иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и туберкулезом).

5. Бесплодие неясного генеза.

6. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.

Культуральный посев является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения. При исследовании биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых случаях можно получить “ложноположительные с клинической точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно однозначно оценить жизнеспособность и патогенность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только данные молекулярно-биологических методов. В этом случае при исследовании клинического материала с помощью культурального посева микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.

Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду (транспортная среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной среды: среда MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 мкг/мл .

Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 ° С и, в течение двух суток должен быть доставлен в лабораторию.

Процедура посева

1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут.

2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных.

3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 45 минут.

4. Отмывка клеток питательной средой.

5. Добавление к клеткам ростовой среды, содержащей циклогексимид.

6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С.

7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.

Реальный срок получения результатов этим методом - семь дней.

В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.

Схема метода выявления устойчивости хламидий трахоматис к антибактериальным препаратам

-Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве, заражают чувствительные клетки.

-К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик.

-Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 ° С.

-Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в зараженных клетках. Процедура длительная, занимает по времени две недели.

Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции

Дороговизна, длительность и трудоемкость микробиологического выделения хламидий в культуре существенно затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике. В литературе накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР для выявления хламидий трахоматис. Особое внимание при его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам правильной интерпретации получаемых результатов. Экстремально высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают эту методику во многом революционной в лабораторной диагностике. Основными мишенями при выявлении хламидий трахоматис являются нуклеотидная последовательность видоспецифической криптической плазмиды, последовательность главного белка внутренней мембраны, рибосомальные гены.

Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94 ° С происходит разделение цепей ДНК, затем при 56-58 ° С - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72 ° С протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5’ –3’ . В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями

По сравнению с широко применяющимися иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:

Реферат опубликован: 16/06/2005 (10603 прочтено)