Страница: 3/4
Основным инструментом филогенетического анализа является сравнение близких по структуре или по функции генов или белков, и прежде всего, сравнение их первичных последовательностей.
Важнейшим свойством функционально значимых структур макромолекул является их эволюционный консерватизм. Чем меньше функциональная важность отдельных участков генов, тем больше они имеют тенденцию к эволюционной изменчивости. Так, например, псевдогены по-видимому полностью утратили функциональную активность. Для них характерно быстрое накопление в ходе эволюции различных замен, делеций и вставок, разрушающих исходную структуру гена. С другой стороны, гистоны Н4, играющие важную роль в упаковке хроматина, почти не изменялись на протяжении всей эволюции животных.
Консервативность генов позволяет выявить отдаленное родство между их представителями, давно разошедшимися в ходе эволюции и выполняющими иногда разные функции. Однако для филогенетического анализа необходимо и наличие определенного уровня изменчивости генов. Мутации, делеции и вставки являются своего рода метками, благодаря которым удается восстановить пути эволюции современных форм макромолекул. Гены с разной величиной консервативности пригодны для изучения разных эволюционных уровней. Сильно консервативные гены и их продукты (гистоны, тРНК) нельзя , например, использовать для исследования эволюции отрядов и более мелких таксонов, но с успехом можно применять для изучения эволюции более крупных таксонов. Сильно вариабельные гены, наоборот, дают хорошее разрешение лишь на поздних эволюционных этапах.
В последнее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом нуклеотидной последовательности широко используется для точной идентификации вирусов и определения их родства в отношении других штаммов. Для сравнительной характеристики геномов различных штаммов вирусов также проводят рестрикционный анализ ПЦР-продуктов. Обычно для построения филогенетического дерева используются данные последовательностей нуклеиновых кислот. Филогенетическое дерево очень ясно показывает родство между вирусами, если анализируется большое количество изолятов. Для этих целей существует много компьютерных программ. Наиболее популярные пакеты программ- PHYLIP(PHYLogeny Inference Package), PAUP(Phylogentic Analysis Using Parsimong),CLUSTAL и MEGA.
Для филогенетического анализа особенно интересны РНК-содержащие вирусы, которые существуют как гетерогенные популяции. Их геном более генетически пластичен, чем геном ДНК-содержащих вирусов.
Так, геном вируса бешенства, который относится к роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae, представлен одноцепочечной негативной РНК длиной около 12000 пар оснований (п.о) , кодирующей пять основных белков.
Белки подразделяются на три функциональные группы: оболочечные (G ,M) нуклеокапсидный (N) и РНК-полимеразный комплекс, состоящий из L и NS белков. Белки N,NS и L вместе с вирионной РНК образуют нуклеокапсид , который окружен мембраной, содержащей трансмембранный гликопротеин G , ответственный за антигенные свойства вируса. Существование псевдогена y между G и L цистронами , является отличительной особенностью вируса бешенства от вируса везикулярного стоматита.
N-ген лиссавирусов, как показало клонирование и секвенирование, является наиболее консервативным по своей структуре из всех генов вируса бешенства.
Mannen K.et al, в 1991 г. определили большую зависимость различий в N-гене от географической локализации, чем от хозяйской специфичности. В Онтарио вирус бешенства, который описан как единственный «Арктический» тип, разделили на четыре основных типа. Эти типы филогенетически разветвляются на две основные ветви , одна из которых состовляет один тип, вторая три основных типа, что отражает историческое передвижение вируса в регионе от середины к концу 50-х гг. Эпизоотия передвигалась на юг Онтарио с севера и Квебека. Изменения в последовательности N-гена , определенных для 4-х вирусных типов, могут представлять генетический маркер для более существенных изменений в других частях вирусного генома.
Kissi et al представили первое сравнение между генотипами и молекулярными различиями N-гена внутри первого генотипа. Филогенетический анализ гена нуклеопротеина 82-х лиссавирусов подтвердил существование шести генотипов лиссавирусов, и также выделил изоляты бешенства первого генотипа в отдельные генетические линии. Изоляты с меньшей чем 80% нуклеотидной и 92% аминокислотной гомологией относятся к различным генотипам. Два коротких региона из 400 нуклеотидов, кодирующих аминоконец N-протеина, и 93 нуклеотида, кодирующих N-NS-регион, могут быть использованы для определения географического распределения основных вирусных линий. Выявлено два региона, имеющих наименьший уровень гомологии: участок длиной 199 пар оснований (нуклеотиды от 1080-го до 1278-го) и более протяженный фрагмент, расположенный между 99-м и 405-м нуклеотидами. Филогенетическое дерево построили, используя пакет программ MEGA. С их помощью получили дерево с ветвями, делящимися на 6 кластеров, которые соответствуют 6-ти генотипам. Сравнение изолятов показало, что в генетическом плане наиболее близкими оказались 4-й и 5-й генотипы, у которых уровень различий составил 79,8% (нуклеотидный уровень) и 93,3% (аминокислотный уровень) [Duvenhage virus (4) и EBL1(5)]. Внутри генотипа 1 наименьшее сходство среди изолятов из Азии и Латинской Америки – 83,3%; и наибольшее сходство в изолятах из Африки и Латинской Америки – 92,2%.
Филогенетический анализ изолятов 1-го генотипа вируса бешенства.
Kissi et al. идентифицировали 11 филогенетических линий, взятых в соответствии с их географическим происхождением и видом хозяина: Африка 1а, Африка 1в, Африка 2, Африка 3, Азия, Арктика, Европа/Средний Восток, Латинская Америка 1 и 2 и две группы вакцинных штаммов. Филогенетическое дерево строилось на основании сравнения фрагмента или целого N-гена.
Этот анализ позволил более точно определить циркуляцию по зонам и установить происхождение и распространение бешенства для некоторых линий, которые, возможно, произошли независимо на этом континенте от различных предшественников. Хотя циркуляция африканских вирусов 1а и 1в более отлично от вирусов, распространенных в Европе и Среднем Востоке, однако была выявлена генетическая связь между ними, что свидетельствует об общем предке.
Выяснено, что накопление большинства нейтральных мутаций в географически разделенных вирусных популяциях привело к значительным расхождениям в нуклеотидной последовательности гена нуклеопротеина.
При исследовании гена нуклеопротеина 11-ти вирусов бешенства японскими учеными было выявлено 9 отдельных кластеров по гомологии менее 90% региона N-гена. Тем самым они подтвердили данные филогенетического анализа, полученные Kissi et al.
Таким образом, варианты вируса бешенства, сгруппированные в соответствии с их географическим распределением, могут быть использованы для исследования эволюционного развития вируса бешенства.
Принципы и методы ОТ-ПЦР.
Обратно-транскриптазная ПЦР состоит из двух этапов:
синтез комплементарной ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы и затравки
амплификация гена или его фрагментов при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3'- концевым последовательностям антипаралельных цепей ДНК гена. Повторяя стадии денатурации, отжига праймеров и полимеризации (достройка праймеров) 30-35 раз за 2-3 часа получают миллионы копий специфического участка генома вирусов и бактерий.
Анализ ПЦР-продуктов.
Аликвоты ПЦР-продуктов разрезают соответствующими ферментами и разделяют в 1%-м агарозном геле. Учет результатов проводят по размеру ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле. На основании размеров и расстояний пробегов маркерных ДНК вычисляют размеры исследуемых фрагментов ДНК.
4. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕКСТОВ.
Выявление и анализ закодированных в последовательностях функциональных сигналов требует применения современных методов информатики - качественных баз данных с современными средствами управления, новейших методов распознавания образов, статистических исследований, применения специальных алгоритмов для преодоления возникающих вычислительных трудностей.
В настоящее время исследование функциональных свойств расшифрованных последовательностей нуклеиновых кислот - это новый раздел молекулярной биологии, граничащий с информатикой, с одной стороны, и молекулярной биофизикой - с другой. Можно с уверенностью сказать, что в настоящее время анализ последовательности биополимера позволяет извлечь лишь очень небольшую долю закодированной в ней информации. В конечном счете точное выявление функциональных особенностей в последовательностях нуклеиновых кислот будет возможно только после детального исследования соответствующих реакций, осуществляемых нуклеиновобелковыми комплексами.
Для оперативной работы с последовательностями создаются специальные банки данных. В банке в доступном для пользователя виде хранится каждая расшифрованная последовательность и ее паспорт, в котором указаны различные сведения о ней. Это сведения об организме, из которого выделена последовательность, о документе, где она описана, о расположении на ней регуляторных участков и белках, которые она кодирует и т.д. В настоящее время созданы три большие базы данных последовательностей нуклеиновых кислот: "Genbank" (Лос-Аламос, США - более 30 млн. нуклеотидов), база данных нуклеотидных последовательностей Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL, Гейдельберг, ФРГ - более 30 млн. нуклеотидов) и "Генэкспресс" (СССР, ВИНИТИ-ИМГ АН СССР - более 11 млн. нуклеотидов). Известны также несколько белковых баз данных, наиболее представительной из которой является MBRF-PIR (США). Эти базы данных распространяются на различных носителях - магнитных лентах и дисках, на оптических дисках.
Реферат опубликован: 15/06/2005 (7965 прочтено)